[发明专利]硫酸软骨素ABC酶融合蛋白制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种表达硫酸软骨素ABC酶融合蛋白的方法，该方法包括：1)分别克隆硫酸软骨素ABC酶基因和3‑磷酸甘油醛脱氢酶蛋白基因，并连接上述基因，使得后续表达的3‑磷酸甘油醛脱氢酶蛋白和硫酸软骨素ABC酶蛋白N端连接；2)将连接的硫酸软骨素ABC酶融合蛋白基因重组到表达载体；3)将含有硫酸软骨素ABC酶融合蛋白基因的表达载体转化到宿主细胞中，进行表达；以及4)收获并纯化表达的硫酸软骨素ABC酶融合蛋白。使用该方法得到的活性硫酸软骨素ABC酶融合蛋白占总表达蛋白量的70％，使得后序纯化过程大大简化。得到的ChSase ABC I融合蛋白具有高酶活，能够用于生产硫酸软骨素，并且硫酸软骨素的生成条件不高、方法简便且容易控制。

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程领域中一种硫酸软骨素酶ABC融合蛋白制备方法及其应用。

背景技术

硫酸软骨素裂解酶(chondroitinase或chondroitin sulfateyase，简称为“ChSase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖(ΔDi及寡糖)的裂解酶。

随着对ChSase的深入研究，发现硫酸软骨素酶ABC(简称为“ChSase ABC”)有着广泛的应用价值。科研人员利用ChSase ABC检测硫酸软骨素和生产低分子量硫酸软骨素。鲍伦军，杨建成等用ChSase ABC酶解-高效液相色谱的方法检测鱼翅中的透明质酸，采用ZORBAX糖分析柱，紫外检测波长为226nm，检测到鱼翅中透明质酸的质量分数为0.86-1.96％(鲍伦军等.鱼翅中硫酸软骨素的酶解-高效液相色谱法测定.色谱,2002,20(6):557-559)。

另外ChSase ABC在临床应用方面也有很大的作用。在缓解视网膜变性方面，可降解硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)，CSPGs是中枢神经系统(CNS)损伤后胶质瘢痕的重要组分，可抑制神经轴突再生。CSPGs主要通过糖氨多糖链抑制神经再生，因此去除GAG或者干扰其合成均可使轴突再生。黄玉苗,高朋芬等通过玻璃体腔注射ChSase ABC酶，免疫荧光法观察CSPGs的表达，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测多功能蛋白聚糖mRNA的表达，检测光感受器凋亡情况，结果表明Chase ABC能通过降解变性大鼠视网膜异常沉积的CSPGs，抑制光感受器细胞的凋亡，从而促进损伤网膜的修复(黄玉苗等.硫酸软骨素酶缓解视网膜变性大鼠光感受器细胞凋亡.扬州大学学报,2012,33(4):19-23.)。

在提高后肢运动能力方面，ChSase ABC可以修复脊柱损伤。脊髓损伤是脊柱骨折的常见并发症，可致肢体瘫痪，大小便失禁及呼吸肌瘫痪等一系列严重并发症，脊髓损伤后神经再生和功能修复，是当今医学领域中的一大难题。孙永新，刘宁等利用ChSase ABC联合高压氧预处理对成年大鼠脊髓损伤后不同时期后肢运动功能及腓肠肌运动终板内乙酰胆碱酯酶(AChE)含量的影响，来检测ChSase ABC的作用。结果表明高压氧预处理可以改善大鼠患肢的运动功能和提高AChE的活性，联合ChSase ABC作用更强(孙永新等.硫酸软骨素酶ABC联合高压氧预处理对脊髓损伤大鼠后肢运动功能的影响.解剖科学进展,2012,18(6):526-529.)。Nicole J.Tester等用ChSase ABC来治疗受伤的猫，ChSase ABC修复了猫的脊柱损伤，提高了猫的运动能力(参见：Nicole J.et al.Chondroitinase ABC improvesbasic and skilled locomotion in spinal cord injured cats.ExperimentalNeurology,2008,209(2):483-496)。