[发明专利]一种同时检测人冠状病毒229E，OC43，NL63和HKU1的实时荧光多重RT-PCR方法

说明书

本发明提供了一种实时荧光多重RT‑PCR的引物和相关试剂盒以及利用该引物同时检测冠状病毒229E、OC43、NL63和HKU1的方法。利用所述引物的实时荧光多量PCR检测方法能够通过扩增产物的溶解温度同时检测四种冠状病毒，操作简单，方便快捷。本发明方法特异性好，灵敏度高，适用于临床和实验室检测。

技术领域

本发明涉及病毒的生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测人冠状病毒229E，OC43，NL63和HKU1的实时荧光多重RT-PCR中使用的引物及相关试剂盒。

背景技术

人冠状病毒(Human coronavirus，HCoV)是具外套膜的单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科。因在电子显微镜下可见如日冕般外围的冠状，因此被称为冠状病毒。目前，已被发现的人冠状病毒的种类有6种。其中四种人冠状病毒(229E，OC43，NL63和HKU1)是目前在人群中常发的，并且与大多数的人呼吸系统疾病相关，例如常见的感冒及具有高发病率的肺炎和支气管炎。冠状病毒的感染分布在全世界多个地区，病毒通过呼吸道分泌物排出体外，经口液、喷嚏、接触传染，并通过空气飞沫传播，感染高峰集中在秋冬和早春。

目前，国内外检测冠状病毒方法主要有以下几种：(1)病毒的分离培养，这也是检测病毒感染的“金标准”。但是其只能检测样本中具有感染能力的病毒颗粒，因而灵敏度不足，并且操作烦琐，耗费时间长，因此并不能用于现场检测。(2)免疫学方法检测病毒的特异性抗体。该方法的不足之处在于具有滞后性，因此并不利于疾病的早期诊断。(3)病毒的核酸分子检测。这类方法克服了上述两种方法灵敏度低的缺点，具体包括反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)和多重实时荧光定量PCR(Multiplex qPCR)，前者无法对病毒的核酸进行定量，后两者通过在PCR反应体系中加入荧光染料或者荧光基团标记的特异性探针不仅实现了对整个PCR进程的实时监测，还可以对模板进行定性和定量，无需电泳，方便的同时也减少污染的发生。目前，还没有操作简单、灵敏度高、实时定量、并且能够同时检测多种冠状病毒的试剂盒上市。

冠状病毒229E，OC43，NL63和HKU1已成为人群呼吸道感染的主要病原体，所引起的呼吸道疾病严重威胁到人类的健康。因此，本领域迫切需要开发同时检测人冠状病毒229E，OC43，NL63和HKU1的实时荧光多重RT-PCR的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种同时检测人冠状病毒229E，OC43，NL63和HKU1的实时荧光多重RT-PCR的试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种检测冠状病毒的引物组合(或引物集)，所述引物组合包括4对引物，分别特异性结合于以下基因并用于扩增对应于所述各基因的特异性扩增产物：冠状病毒229E的M基因、冠状病毒OC43的N基因、冠状病毒NL63的N基因和冠状病毒HKU1的N基因。

在另一优选例中，所述冠状病毒包括人冠状病毒。

在另一优选例中，所述各基因的特异性扩增产物的长度L1、L2、L3和L4均为150-700bp，较佳地160-600bp，更佳地180-550bp。

在另一优选例中，所述冠状病毒229E、OC43、NL63和HKU1的扩增产物的溶解温度(T1、T2、T3、T4)各不相同，且相互之间相差至少0.2℃，较佳地至少0.5℃。

在另一优选例中，所述冠状病毒229E、OC43、NL63和HKU1的扩增产物的溶解温度(T1、T2、T3、T4)相互之间相差(差值)≥1℃。

在另一优选例中，所述冠状病毒HKU1的扩增产物的溶解温度为77-79℃，所述冠状病毒NL63的扩增产物的溶解温度为79-82℃，所述冠状病毒229E的扩增产物的溶解温度为82-84℃，并且所述冠状病毒OC43的扩增产物的溶解温度为84-86℃。

在另一优选例中，所述的各基因的特异性扩增产物的长度L1、L2、L3和L4各不相同，且相互之间相差至少5bp。