[发明专利]一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法

权利要求书

1.一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)一个制备生菜保卫细胞原生质体的步骤；所述的生菜保卫细胞的分离是通过酶解分离法进行的；

2)一个提取生菜保卫细胞原生质体蛋白质的步骤；将步骤1)获得的得到的生菜保卫细胞原生质体通过丙酮沉淀法提取；

3)一个测定生菜保卫细胞原生质体蛋白质的步骤，所述的测定是通过考马斯亮蓝G-250法测定的；

4)一个测定蔗糖转化酶活力的步骤；得到的保卫细胞通过酶联的方法测定酶化学反应的产物即葡萄糖含量，根据所产生的葡萄糖量、反应时间、保卫细胞的蛋白质含量计算蔗糖转化酶的活性，酶活力＝葡萄糖的质量/(反应时间×保卫细胞总蛋白量)，其中葡萄糖的质量单位为毫克，反应时间的单位为小时，保卫细胞总蛋白量的单位为微克。

2.根据权利要求1所述的一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法，其特征在于：步骤1)中采用的酶为纤维素酶。

3.根据权利要求1所述的一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法，其特征在于：一个制备生菜保卫细胞原生质体的步骤如下：

(1)取生菜叶片,然后放于蒸馏水中，在玻璃板上撕取表皮条，用毛笔刷除去叶肉细胞，将收集到的表皮条切碎后放入到基质中冲洗；

(2)过滤后放入到酶解液中，25～30℃水浴反应0.5～2h后，在显微镜下观察气孔开度，气孔开度呈饱满椭圆状时终止反应，过滤后用基质冲洗，再用悬浮液悬浮表皮条，收集表皮条；所述的基质包括抗坏血酸、CaCl₂、MgCl₂、KH₂PO₄、Mes和山梨醇，在所述的基质中，所述的抗坏血酸的浓度为0.5mmol/L、CaCl₂的浓度为0.5mmol/L、MgCl₂的浓度为0.5mmol/L、KH₂PO₄的浓度为10μmol/L、Mes的浓度为5mmol/L，山梨醇的浓度为540mM，PH为5～6；

所述的酶解液包括纤维素酶、PVP-40、BSA、KH₂PO₄和抗坏血酸，在所述的酶解液中，纤维素酶的质量百分比浓度为0.7％、PVP-40的质量体积比浓度为0.1％、BSA的质量体积比浓度为0.25％、抗坏血酸的浓度为0.5mmol/L，使用时，在酶解液中加入基质溶液，所述的酶解液和基质溶液的体积比为55:45；

所述的悬浮液包括山梨醇、CaCl₂、MgCl₂和Mes，在所述的悬浮液中，山梨醇的浓度为0.54mol/L，CaCl₂的浓度为1mmol/L，MgCl₂的浓度为2mmol/L，Mes的浓度为5mmol/L，PH为5.5。

4.根据权利要求1所述的一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法，其特征在于：一个提取生菜保卫细胞原生质体蛋白质的步骤如下：

(1)将步骤1)获得的得到的生菜保卫细胞原生质体中加入提取缓冲液，所述的提取缓冲液由质量百分比浓度为1％的SDS、甘油、巯基乙醇和双蒸水组成，所述的SDS、甘油、巯基乙醇和双蒸水的体积比为1ml：2ml：1ml：16ml，摇匀并放在1～6℃条件下提取3～10min；

(2)放置后的样品充分摇匀，4℃条件下离心，上清液移入中加入2.5～3倍体积的预冷的丙酮-10～-30℃条件下过夜，之后，4℃条件下离心，弃上清，沉淀置于通风厨内使丙酮完全挥发，加入上样缓冲液溶解沉淀，沉淀充分溶解后，离心，取上清液即为所提取的生菜保卫细胞原生质体蛋白质溶液。

5.根据权利要求1所述的一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法，其特征在于：一个测定蔗糖转化酶活力的步骤如下；

(1)在生菜保卫细胞原生质体中加入悬浮液，在原生质体悬浮混合液加入0.1M蔗糖开始反应，原生质体悬浮混合液和蔗糖溶液的体积比为1:9，25～35℃反应0.6～1.5h，80～90℃保温2～5min；对照组是采用水替换原生质体悬浮混合液，在水中加入蔗糖，水和蔗糖溶液的体积比为1:9，在85℃保温2～5min；

(2)将原生质体悬浮液组和对照组分别研磨，然后加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，氯仿和异戊醇的体积比为24:1，离心后取上清；

(3)再加入7～15％体积的1M Tris-HCl溶液进行反应；

(4)再取上述溶液，加入2.5～3倍体积的缓冲液，所述的缓冲液包括N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸-氢氧化钾、氯化镁、三磷酸腺苷、己糖激酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和依赖于NADP的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，在所述的缓冲液中，N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸-氢氧化钾的浓度为100mM，氯化镁的浓度为2.25mM、三磷酸腺苷的浓度为1.1mM、己糖激酶的使用量为0.2单位、NADP的浓度为1.1mM、依赖于NADP的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的使用量为0.2单位，反应后，通过测定340nm的吸光值确定葡萄糖含量。