[发明专利]一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法

说明书

本发明提供了一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法，包括一个制备生菜保卫细胞原生质体的步骤；所述的生菜保卫细胞的分离是通过酶解离法进行的；一个提取生菜保卫细胞原生质体蛋白质的步骤；将获得的得到的生菜保卫细胞原生质体通过丙酮沉淀法提取；一个对测定生菜保卫细胞原生质体蛋白质的步骤，所述的测定是通过考马斯亮蓝G‑250法测定的；一个测定蔗糖转化酶活力的步骤；得到的保卫细胞通过酶联的方法测定酶化学反应的产物即葡萄糖含量，根据所产生的葡萄糖量、反应时间，保卫细胞的蛋白质含量计算蔗糖转化酶的活性。本发明解决了现有技术中测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力困难的技术问题。

技术领域

本发明属于生物学领域，涉及一种蔗糖转化酶的测定方法，具体来说是一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法。

背景技术

在植物生理研究和教学过程中，需要进行特定器官或组织蛋白酶的测定。虽然蔗糖转化酶的测定方法已有不少报道，但组成植物与外界进行气体和水分交换的气孔的细胞，即保卫细胞的蔗糖转化酶活力仍然较难测定。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法，所述的这种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法解决了现有技术中测定保卫细胞的蔗糖转化酶活力困难的技术问题。

本发明提供了一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法，包括如下步骤：

1)一个制备生菜保卫细胞原生质体的步骤；所述的生菜保卫细胞的分离是通过酶解离法进行的；

2)一个提取生菜保卫细胞原生质体蛋白质的步骤；将步骤1)获得的得到的生菜保卫细胞原生质体通过丙酮沉淀法提取；

3)一个测定生菜保卫细胞原生质体蛋白质的步骤，所述的测定是通过考马斯亮蓝G-250法测定的；

4)一个测定蔗糖转化酶活力的步骤；得到的保卫细胞通过酶联的方法测定酶化学反应的产物即葡萄糖含量，根据所产生的葡萄糖量、反应时间、保卫细胞的蛋白质含量计算蔗糖转化酶的活性，酶活力＝葡萄糖(毫克)/[反应时间(小时)*保卫细胞总蛋白量(微克)]。

进一步的，步骤1)中采用的酶为纤维素酶。

进一步的，一个制备生菜保卫细胞原生质体的步骤如下：

(1)取生菜叶片,然后放于蒸馏水中，在玻璃板上撕取表皮条，用毛笔刷除去叶肉细胞，将收集到的表皮条切碎后放入到基质溶液中冲洗；

(2)过滤后放入到酶解液中，25～30℃水浴反应0.5～2h后，在显微镜下观察气孔开度，气孔开度呈饱满椭圆状时终止反应，过滤后用基本介质冲洗，再用重悬液悬浮表皮条，收集表皮条。

进一步的，所述的基质溶液由抗坏血酸、CaCl₂、MgCl₂、KH₂PO₄、Mes和山梨醇组成，在所述的基质溶液中，所述的抗坏血酸的浓度为0.5mmol/L、CaCl₂的浓度为0.5mmol/L、MgCl₂的浓度为0.5mmol/L、KH₂PO₄的浓度为10μmol/L、Mes的浓度为5mmol/L，山梨醇的浓度为540mM，PH为5～6。

进一步的，所述的酶解液由cellulysin、PVP-40、BSA、KH₂PO₄、抗坏血酸组成，在所述的第一酶解液中，cellulysin的质量百分比浓度为0.7％、PVP-40的质量体积比浓度为0.1％、BSA的质量体积比浓度为0.25％、抗坏血酸的浓度为0.5mmol/L，使用时，在第一酶解液中加入基质溶液，所述的第一酶解液和基质溶液的体积比为55:45。