[发明专利]一种胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法。

背景技术

干细胞(stemcell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC具有自我复制、自我更新、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性。在特定的机体外分化环境下，能够诱导分化为神经、心脏、骨、软骨、脂肪、上皮等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术的最有希望的来源细胞之一。除此以外，间充质干细胞能分泌多种营养物质，包括血管内皮生长因子(vEGF)、胎盘生长因子(PGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)等在内的各种生长因子，这些生长因子可参与多种细胞反应，促进细胞生长，而收集条件培养基是获得这些活性成分的有效方法。

人羊膜来源于人胎盘组织，无血管、神经及淋巴，羊膜属于孕妇生产后的废弃物，一个胎盘的羊膜面积大约有600cm²，而且羊膜易于从胎盘剥离，所以因羊膜具有取材方便，原料充足的特点而被认为是目前间充质干细胞的最佳来源，是未来干细胞在医疗应用上具有巨大潜力的理想种子细胞。

间充质干细胞在体外经过连续传代培养和冻存复苏后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此，研究一种有效的胎盘羊膜间充质干细胞的冻存方法，使具有临床应用价值的胎盘羊膜间充质干细胞能在体外长期保存并维持原有的多向分化能力，显得尤为重要。

胎盘羊膜间充质干细胞的冻存需要将处于对数生长期的细胞收集起来，加入含有特定成分的细胞冻存保护液制成单细胞悬液，分装于冻存管中置于超低温冰箱或者液氮中进行长期冻存。

目前现有技术中，胎盘羊膜间充质干细胞的细胞冻存保护液配方一种是以DMSO和血清为主要成分，另一种是以培养基、DMSO和血清为主要成分。此外还有一些配方是在上述两种配方的基础上添加其他保护细胞的物质。但上述配方冻存胎盘羊膜间充质干细胞均效果不理想，复苏后细胞回收率及细胞活率低。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液及冻存方法。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液，包括

DMSO10v/v％-20v/v％

胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基30v/v％-80v/v％

胎牛血清10v/v％-50v/v％。

其中，所述胎盘羊膜间充质干细胞的冻存保护液中所述胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基的制备方法为：取P1-P5代的胎盘羊膜间充质干细胞酶解消化后传代，连续培养24-72h后，收集培养上清，离心后取上清。

在一些实施方案中，所述胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述P1-P5代的胎盘羊膜间充质干细胞优选为汇合度80-90％胎盘羊膜间充质干细胞。

在一些实施方案中，所述胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述酶解消化具体为向细胞中加入0.015mL/cm²-0.04mL/cm²的0.05％-0.3％的胰酶和0.01％-0.04％EDTA消化1min-3min，完全培养基终止酶解。

在一些优选实施方案中，所述终止酶解的完全培养基的加入量为消化液体积的5倍～10倍。

在一些实施方案中，所述胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基的制备方法中所述传代为酶解消化后的细胞离心，完全培养基重选后，按80000个细胞/cm²-15000个细胞/cm²的传代密度传代，细胞连续生长24h-72h。

其中，所述酶解消化后的离心优选为200g-400g离心5min。

本领域技术人员可以理解，本发明所述完全培养基的组成为DMEM-F1280v/v％-95v/v％，FBS5v/v％-20v/v％。

本发明所述胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基的制备方法在胎盘羊膜间充质干细胞传代后收集培养上清，离心后取上清获得胎盘羊膜间充质干细胞条件培养基。其中，所述离心优选为200g-400g离心5min。