[发明专利]一种高催化活性的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体

权利要求书

1.一种短小芽胞杆菌CotA漆酶的突变体，其特征在于，是以L386W/G417L双突变的短小芽胞杆菌CotA漆酶基因为模板将其第152位的Asp分别突变为Phe、Cys、Tyr、Trp。

2.权利要求1所述的突变体的制备方法，包括如下步骤：

(1)以前期构建的双突变体质粒pColdII-CotA(WL)为模板，采用滚环PCR的方法，设计引物时在重叠区域引入突变位点，利用PCR扩增质粒pColdII-CotA(WL)得到含有编码CotA漆酶突变体的基因序列的开环重组载体；

(2)在PCR产物中加DMT酶消化PCR产物，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳回收片段；

(3)利用特殊的重组酶和同源重组原理，将开环重组载体无缝拼接，形成环状结构；

(4)将环状质粒转化到DMT感受态细胞中，平板培养挑取单菌落测序，为的是提取到正确突变质粒；

(5)将正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达。

3.根据权利2所述的方法，其特征在于，还进一步包括使用AVANT蛋白纯化仪和HisTrapHP1mL镍柱、脱盐柱、阴离子交换柱对漆酶进行纯化。

4.根据权利2所述的方法，其特征在于，将步骤(5)获得的重组菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入含有氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37℃培养至OD₆₀₀≈0.5，迅速降温至15℃静置至少30min，加入最终浓度0.4mM的诱导剂IPTG诱导，24h时离心获得沉淀，用缓冲液重悬，即为粗酶液。复合突变体L386W/G417L/D152C对底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)具有更高的催化活性，是野生型的2.6倍，且专一性是野生型的4.0倍。