[发明专利]一种高催化活性的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体

说明书

技术领域

本发明涉及一种催化活性提高的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

漆酶(laccase,E.C.1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶，能催化酚类物质的氧化还原反应，在木质素及其前体类似物的生物降解中发挥重要作用。漆酶的氧化底物极为广泛，包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，因此漆酶应用潜力巨大。在木材加工领域，漆酶能代替化学胶合剂，不但能提高产品质量，而且能减轻对人体健康的伤害及对环境的污染；在造纸工业中，漆酶用于纸张生物漂白和制浆，可减少制浆造纸厂的污染，有助于造纸业最终实现清洁生产；在食品加工领域，漆酶可用于除去果汁中酚类化合物引起的混浊，从而提高果汁的质量。此外，漆酶还可氧化氯酚及其衍生物，降低其毒性，减少以氯酚类为工业原料生产染料、防腐剂、除草剂、杀虫剂等化工产品而造成的环境污染。

漆酶按来源不同可分为三大类：植物漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。细菌漆酶包括芽胞杆菌属的CotA蛋白、海单胞菌的PpoA蛋白、大肠杆菌的CueO蛋白、灰色链霉菌的EpoA蛋白等，与真菌及植物漆酶蛋白结构相似，都具有4个铜离子结合位点。

本实验室前期已从自行筛选的短小芽胞杆菌菌株W3(BacilluspumilusW3)中克隆并重组表达了CotA漆酶，研究发现该CotA漆酶相对其它种类漆酶具备以下优点：碱性pH下酶活性高、耐高温且热稳定性好、能耐受高浓度有机溶剂及卤素离子环境等，这些优良特性正是目前漆酶在印染废水处理领域进行工业化应用所急需的。然而，野生短小芽胞杆菌CotA漆酶天然表达量非常低，且底物专一性较差，催化活性偏低，成为工业化应用的瓶颈。因此本发明利用基因工程和酶工程手段，提高短小芽胞杆菌CotA漆酶的催化活性，进一步提高其工业化应用前景。

发明内容

本发明提供了一种短小芽胞杆菌漆酶突变体，该突变体以本实验室前期已改造获得的双突变体L386W/G417L漆酶基因为模板，进一步将双突变体的第152位天冬氨酸(Asp，D)分别突变为苯丙氨酸(Phe，F)、半胱氨酸(Cys，C)酪氨酸(Tyr，Y)、色氨酸(Trp，W)，随后以野生型CotA漆酶为对照，最终选择出对底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)具有更高专一性的突变体。

所述B.pumilusCotA漆酶的亲本氨基酸序列与NCBI数据库中的B.pumilusCotA漆酶氨基酸序列一致(由本实验室提交，GenBank登录号：KF040050)。

所述突变体是将双突变体L386W/G417L漆酶基因中第152位的Asp分别突变成了Phe、Cys、Tyr、Trp，分别命名为L386W/G417L/D152F、L386W/G417L/D152C、L386W/G417L/D152Y、L386W/G417L/D152W。

附图说明

图1：野生短小芽胞杆菌CotA漆酶三维模拟结构

图2：构建突变体质粒过程的分子操作原理示意图

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1野生短小芽胞杆菌CotA漆酶的表达与纯化。

从甘油管接种前期构建的重组表达菌株CotA/pColdII/BL21(DE3)于LB液体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)过夜培养，按2％接种量将种子接入LB液体发酵培养基(含100mg/L)。大肠杆菌在37℃培养2h后，加入0.4mM终浓度的IPTG进行诱导，并在15℃摇床继续发酵培养24h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min去除上清，收集菌体。将收集的菌体用磷酸盐缓冲液重悬，重悬后用超声波细胞破碎仪将菌体破碎释放胞内蛋白，破碎完成后，将破碎的液体于4℃、8000rpm离心10min收集上清。收集的上清用于CotA漆酶蛋白纯化。