[发明专利]一种培养基及其应用、培养方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种培养基及其应用、培养方法。该培养基包括转铁蛋白、重组人胰岛素、孕酮、胎牛血清、干细胞生长因子、维生素C、白介素2、白介素4、硫酸锌和DMEM/F12培养基。本发明培养基在培养CD19‑CAR‑T细胞时，能够提高细胞的增殖倍数，延长细胞培养天数，并能够保持表达CD19CAR等表面标志物。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种培养基及其应用、培养方法。

背景技术

套式淋巴瘤(Mantle cell lymphoma)属于非霍奇金淋巴瘤(NHL)的一种，大约70％的病人在诊断时已处于III期或Ⅳ期病变。临床上经典的CHOP(环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松)方案对套式淋巴瘤的治疗疗效不满意，只有少数病人达到完全缓解，因此亟需新的治疗策略来改善疗效。

随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，过继细胞免疫治疗近年来取得了长足的进步，其中以嵌合抗原受体(chimericantigen receptor，CAR)修饰的T细胞为代表的肿瘤靶向免疫治疗的成就尤为突出，在体外和临床试验中表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性，展示了巨大的应用潜力和发展前景。

CAR-T细胞治疗的原理在于经嵌合抗原受体修饰的T细胞，可以特异性地识别肿瘤相关抗原，使效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态，即表达CAR的T细胞以抗原依赖、非MHC限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。

大多数嵌合抗原受体由胞外抗原结合区(由来源于单克隆抗体的轻链VL和重链VH，中间经带韧性的铰链区连接形成的单链抗体(single chain fragment variable，scFv)、跨膜区域和胞内信号转导区组成。

目前正在开发的针对血液系统恶性肿瘤的CAR种类很多，主要包括利用抗CD19、抗CD20、抗Kappa轻链、抗CD22、抗CD23、抗CD30、抗CD70等抗体构建CAR修饰的T细胞或NK细胞进行抗肿瘤研究，其中抗CD19单克隆抗体为基础构建的CAR在临床上取得的成就最为突出。靶向CD19分子的嵌合体抗原受体基因修饰的T细胞(CD19-CAR-T)在治疗多发性、难治性的急性淋巴细胞白血病(ALL)上获得了巨大成功，美国宾夕法尼亚大学的研究小组的临床试验结果显示，高达90％以上的难治性、复发性ALL患者获得完全缓解。

2011年宋德刚在文献《表达嵌合性抗原受体的T淋巴细胞介导的肿瘤过继性免疫治疗作用的临床前研究》中使用RPMI1640+10％FBS培养基培养CAR-T细胞。但采用RPMI1640+10％FBS去培养转染后的T细胞存在诸多缺点：

1、转染后的T细胞无法大量增殖，因为会出现基因丢失的风险，通常CD4⁺和CD8⁺细胞增殖倍数在50倍左右；

2、培养天数有限，通常只能培养7天左右；

3、培养后细胞的嵌合抗原受体的表达会有所降低，以转染CD19CAR的T细胞为例，即使转染效率达到90％以上，通常培养7天后CD19CAR表达的细胞比例会降至60％左右。

因此，急需提供一种能够有效促进CAR-T细胞增殖并能高效表达CAR的培养基及其培养方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种培养基及其应用、培养方法。该培养基在培养CD19-CAR-T细胞时，能够提高细胞的增殖倍数，延长细胞培养天数，并能够保持表达CD19CAR等表面标志物。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种培养基，包括转铁蛋白、重组人胰岛素、孕酮、胎牛血清、干细胞生长因子、维生素C、白介素2、白介素4、硫酸锌和DMEM/F12培养基。