[发明专利]一种非衍生快速检测药用植物中结合氨基酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种非衍生快速检测药用植物中结合氨基酸的分析方法，属于中药材成分分析领域。

背景技术

氨基酸是含有氨基的羧酸，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单元。在自然界中主要以游离氨基酸和结合氨基酸两种形式存在。药用植物中两种形式皆存在，除具有营养价值外，在发挥药效时亦起着不可或缺的作用。其次，氨基酸含量的高低，可作为药用植物药性判别的依据。而且，指标性氨基酸可用于定性鉴别中药材。因此，药用植物中氨基酸分析对于药用植物鉴别，质量评估及其相关产品的开发利用提供实验依据。由于大多数氨基酸的极性高、挥发性低、无强发色基团，造成其分离和检测极具挑战性。氨基酸分析仪法和色谱法是氨基酸分析最有效和最常用的方法，分析前预处理是确保分析结果准确无误的关键环节之一。

结合氨基酸前处理方法有传统的酸、碱和酶水解法，以及非传统的微波酸、碱和酶水解法。其目的在于破碎组织细胞，使结合氨基酸键断裂释放出游离氨基酸。传统的酸、碱或酶水解法水解时间长，存在水解过程繁琐，能耗高，不适宜于快速检测大量样品以及氨基酸水解率较低等缺点。另外，微波水解较常规的酸、碱和酶水解法相比较，耗时较短，但是微波水解方法的准确度有待于实验对比数据的讨论分析和同行的认可。

氨基酸类物质的水解率很大程度上取决于对样品材料的细胞破壁状况，目前破壁的方法有超声水解和微波水解等方法，但是他们存在诸多问题，如耗时或细胞破碎不完全，导致结合氨基酸水解耗时耗能，水解效率低。高压脉冲电场（High-voltagepulsedelectricfield，简称HPEF）技术是近年来发展起来的一种新技术，机理是利用细胞膜电穿孔原理在瞬间使细胞破壁，造成细胞膜电位混乱，细胞壁和细胞膜发生可逆或不可逆的破坏，细胞组分流出。HPEF法引入氨基酸分析的前处理领域，具有处理时间短、能耗低、不易引起目的产物变性等优点，对更加客观评价和利用药用植物资源，保护生态环境，节约能源，降低劳动成本具有重要的意义。

另外，传统的氨基酸水解液在上柱前往往需要使用昂贵的萃取小柱进一步纯化，以减少后期对分析色谱柱的污染。本专利则采用将氨基酸水解液冷冻复溶的方法，使得冷冻后不溶于水解液溶剂的部分杂质通过过滤和离心的方式去除掉，可以大大减低纯化成本和简化操作。

氨基酸测定的方法主要有氨基酸分析仪法和色谱法。氨基酸分析仪由于价格昂贵和专用分析柱价格高而缺乏普遍适用性。色谱方法主要有液相色谱法(LC)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳法(CE)、离子交换色谱法(IEC)及液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)。从衍生角度可总结为衍生法和未衍生法两种。首先衍生然后通过液相色谱-紫外检测法，液相色谱-荧光检测法，气相色谱法(GC)，毛细管电泳法(CE)或液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)法进行检测。其次未衍生法主要是HPLC（UPLC）-ELSD法和HPLC（UPLC）-MS法以及离子交换色谱法。

衍生化后通过紫外，荧光和质谱法检测氨基酸，虽然灵敏度和分离度得到较大程度的提高。但是，存在较多弊端，如有的衍生法不能检测亚氨基酸及含硫氨基酸，衍生物稳定性差，存在过量衍生试剂及副产物干扰、耗时以及个别氨基酸衍生化困难和不适宜大批次样品的检测等问题。另外，目前的未衍生法，大多采用专用方法包，专用色谱柱和专用流动相，如WatersAccQ·TagTMUltraC18(1.7μm,2.1×100mm)，AccQ·TagUltraEluentA及AccQ·TagUltraEluentB等由于价格昂贵而不经济实用。

发明内容

本发明提供一种非衍生同时快速检测药用植物中结合氨基酸的方法。针对前期氨基酸分析前处理及分析方面的不足，提出全新的快速检测方法。

本发明的技术解决方案如下：首先采用高压脉冲电场法对样品进行组织细胞破裂及酸水解，然后将水解液冷冻再融化，最后采用超高压液相色谱-蒸发光散射法对样品液进行氨基酸含量测定。本发明采用高压脉冲电场法酸水解氨基酸具有操作简单，样品水解快速完全，试剂用量少，快速节能，环境污染小等优点。另外，分析前处理过程利用冷冻复溶，通过“冰吐”作用纯化目标物，减少对分离柱的污染，延长色谱柱的使用寿命；分析过程中采用耐水的C18柱，有机试剂消耗少，绿色环保；最后采用蒸发光散射检测器无需衍生，操作简便，不引入衍生试剂及副反应，适宜于大批次样品的检测，有较好的实用价值和前景。

本发明所述的一种非衍生同时快速检测药用植物中结合氨基酸的分析方法，主要包括以下步骤：