[发明专利]估算烟草N导入片段左端长度的分子标记、引物及方法

权利要求书

1.一种估算烟草N导入片段左端长度的方法在选育烟草抗TMV品种和在烟草TMV抗病基因定位中的应用，其特征在于步骤如下：

以GL4.06引物对或GL3.50引物对为引物，以待检测的包含N导入片段的烟草基因组DNA为模板，进行PCR 扩增，扩增产物进行电泳检测，如扩增出对应大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Samsun NN无差异；如没有扩增出对应大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Samsun NN短；所述的分子标记为Seq ID No.1 或Seq ID No.2所示序列；其中，

当以所述的GL4.06引物对进行PCR 扩增，如果扩增出391bp大小的DNA片段，即Seq IDNo.1所示序列的分子标记，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Samsun NN无差异；如没有扩增出391bp大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Samsun NN短；

当以所述的GL3.50引物对进行PCR 扩增，如果扩增出654bp大小的DNA片段，即Seq IDNo.2所示序列的分子标记，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Samsun NN无差异；如没有扩增出654bp大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Samsun NN短；

所述的GL4.06引物对的序列如下：

GL4.06-F1：5’-gatcccacgagtggagca-3’，

GL4.06-R1：5’-tcctcaccaaacccaacttt-3’；

所述的GL3.50引物对的序列如下：

GL3.50-F1：5’-ttgagaaccgtccaatttcc -3’，

GL3.50-R1：5’-cccctgagtcgaacaagtcaa-3’。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的PCR 的反应体系如下：

DNA模板50 ng/μL 2.5 μL，

10×PCR buffer 2.0 μL，

dNTPs 2.5mM 1.2 μL，

引物对中的引物10umol/μL 各1.5 μL，

Ex-Taq DNA酶5U/μL 0.3 μL，

ddH2O 余量，

总体积为20 μL。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的PCR反应程序：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。