[发明专利]估算烟草N导入片段左端长度的分子标记、引物及方法

说明书

本发明涉及一种估算烟草N导入片段左端长度分子标记、引物及方法。该分子标记为Seq ID No.1或Seq ID No.2所示序列。该估算方法是以GL4.06引物对或GL3.50引物对为引物，以待检测的包含N导入片段的烟草基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后电泳检测，如扩增出对应大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Samsun NN相当；如没有扩增出，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Samsun NN短。该方法可以简便、快速、高通量地应用于烟草TMV抗病基因定位和选育烟草抗TMV品种中，有利于减少与N基因连锁的累赘。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及估算烟草N导入片段左端长度的分子标记、引物及方法。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、以及该分子标记和引物在烟草TMV抗病基因定位或选育烟草抗TMV品种中的应用。

背景技术

烟草花叶病毒病(Tobacco mosaic virus,TMV)是我国烟草上的重要病害，每年造成的损失位列十大烟草侵染性病害名单前列。生产上主要采取培育无毒苗、药剂防治和销毁田间病残体等措施进行防治，在控制TMV的发生流行上取得了一定的效果，但TMV在局部田块爆发的情况仍然时有发生，造成较大的经济损失。因此，种植TMV抗病品种依然是防控TMV最根本同时也是最经济有效的手段。抗病品种的推广需要抗性高、且无产量劣势和农艺性状劣势的品种。

目前烟草的TMV抗源主要来源于烟草野生种心叶烟(Nicotiana glutinosa)，其抗性由一个显性单基因(N)控制。N基因在1994年被克隆，是植物中克隆的第一个NBS类抗病基因。N基因抗TMV-U1株系。N基因的基因组序列大小为6656bp，包括5个外显子和4个内含子，属于TIR-NBS-LRR类型抗病基因。N基因的抗病机理为在病毒侵染位点出现过敏性坏死斑(枯斑)，通过诱导产生的细胞过敏性死亡限制TMV在植物体内的移动。在介导了过敏反应后，烟草植株能够获得系统性抗性，对TMV或其它类似病原的再次入侵产生广谱抗性。通过一系列的常规杂交和回交转育，N基因的抗性从心叶烟转育至香料烟中，然后转育至烟草品种中。

采用杂交育种转育N基因的抗性，实际上是转育包含N基因的野生烟染色体片段(简称为N导入片段)。世界上抗TMV烟草育种利用的几乎都是N导入片段。代表性品种是较早商业化种植的包含N导入片段的抗TMV烟草品种Cok er176和Speight H20。

由于产量较低、上部叶落黄较慢等连锁累赘，包含N导入片段的烟草品种不能满足生产的迫切需要。已有研究证明N基因本身无产量和产值的连锁累赘，连锁累赘来源于N导入片段上的其他基因。N导入片段较短的枯斑资源，推测其连锁累赘可能较小，育种利用潜力较大。尽管N基因在20年前被克隆，但N导入片段的长度和伴随的累赘基因一直不清楚，限制了的N基因在商业品种中的应用。常规育种技术无法估算N导入片段的长度，产量、落黄和烘烤等性状为数量性状，在育种早期难以选择。估算N导入片段长度的技术手段缺乏，导致抗TMV烟草育种缺乏突破性进展。因此如何克服现有技术的不足是目前烟草抗TMV育种技术领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种估算烟草N导入片段左端长度的分子标记、引物及方法，该分子标记、引物及方法可用于筛选N导入片段较短的资源和育种单株，达到减少N导入片段的连锁累赘的效果，为选育出高抗TMV，且无明显产量和质量劣势的烟草品种提供技术手段。

本发明的目的是提供估算烟草N导入片段左端长度的分子标记。

本发明的另一目的是提供一种估算烟草N导入片段左端长度的PCR扩增方法所用的引物对。