[发明专利]大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品的制备、应用和试剂盒在审
| 申请号： | 201510729592.5 | 申请日： | 2015-10-29 |
| 公开（公告）号： | CN105238765A | 公开（公告）日： | 2016-01-13 |
| 发明（设计）人： | 崔红;李哲群;商兴芳;吴秋保;曾家琨 | 申请（专利权）人： | 广州呼研所生物技术有限公司;广东和信健康科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N7/00 | 分类号： | C12N7/00;C12Q1/70;C12Q1/68 |
| 代理公司： | 广州华进联合专利商标代理有限公司 44224 | 代理人： | 林青中;万志香 |
| 地址： | 510530 广东省广州市广州高新技术产业*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 大肠杆菌噬菌体 ms2 内标质控品 制备 应用 试剂盒 | ||
1.一种大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)宿主菌的制备：挑大肠杆菌ATCC15597菌种接种在固体培养基上培养；再挑取单菌落接种至液体培养基中，扩大培养，得到含宿主菌的培养液；
(2)噬菌体MS2单克隆的制备：挑噬菌体MS2用双层琼脂平板培养法培养18-24小时，再挑取单个噬菌斑至含宿主菌的液体培养基中培养20-24h，得到含噬菌体MS2的培养液；
(3)噬菌体MS2的扩大培养：将步骤(1)制备的含宿主菌的培养液接种到液体培养基中，培养4-5小时，得到细菌培养液，再将步骤(2)制备的含噬菌体MS2的培养液接种到细菌培养液中，培养过夜，取培养液离心，收集上清液，过滤即得到纯化的噬菌体MS2悬液；
(4)噬菌体MS2的分析检测：取步骤(3)制备的噬菌体MS2用荧光RT-PCR法检测Ct值，并用双层琼脂法测效价；
(5)噬菌体MS2内标质控品的制备：用冻干稀释液将噬菌体悬液稀释至Ct值为18-20，分装于离心管中，真空冷冻干燥，将所得冻干品冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述荧光RT-PCR法检测Ct值针对噬菌体MS2的扩增引物为SEQIDNO:4和SEQIDNO:5。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述荧光RT-PCR法检测Ct值针对噬菌体MS2的探针为SEQIDNO:6。
4.根据权利要求1-3任一项所述的大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述冻干稀释液为含有质量分数为0.8-1.2％的牛血清白蛋白和体积分数为45-55％的吐温20的水溶液。
5.根据权利要求1-3任一项所述的大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述真空冷冻干燥的温度为-50℃，压力为0.2mTorr，所述冷冻保存的温度为-20℃。
6.一种大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品，其特征在于，由权利要求1-5任一项所述的制备方法制备而成。
7.权利要求6所述的大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品在RNA病原体的荧光RT-PCR检测过程中作为内标质控品的应用。
8.一种RNA病原体荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包含检测试剂和内标质控品，所述内标质控品为权利要求6所述的大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品。
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