[发明专利]大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品的制备、应用和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病原体诊断技术领域，具体涉及一种大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品的制备、应用和试剂盒。

背景技术

随着分子生物学技术的迅速发展，以聚合酶链式反应为基础的各种分子生物学诊断技术，因其具有特异性强，灵敏度高，重复性好，定量准确，方便快捷等优点，成为生物医学领域内最有价值的研究手段，已经广泛应用于临床标本的检测。在RNA病毒的RT-PCR检测中，影响实验过程的因素较多，如实验人员测定操作中的随机误差、扩增仪孔间温度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、待扩增靶核酸的浓度、逆转录的效率及试剂问题等，这些因素均可能会影响PCR扩增的效率，进而造成结果的偏差。因此，在做核酸特别是RNA扩增实验时，需要有严格的质量控制措施，即需要有特定的质控物。质控物须具备以下特点：(1)易制备；(2)在贮存和使用过程中稳定性好；(3)无生物传染性；(4)能监控整个检测过程，结果可靠。

传统的RNA病毒检测的内标质控品有三种：样本中看家基因片段(以β-actin为例)，以及质粒DNA，假病毒，但这些质控品都有各自的弊端。样本中β-actin，若取样不成功直接影响其结果的判断，虽然看家基因与目的基因为非竞争性扩增，但如果在样本中目的基因与β-actin的浓度相差10倍以上，直接干扰和影响目的检测片段的判断；质粒DNA虽然稳定性好，但在RNA病毒的RT-PCR中和样本不属于同源核酸，而且质粒易污染实验室，所以也不宜作为质控品对RNA进行监控；假病毒较之前面两种，是比较理想的选择，但是其要求一定的技术支持，操作繁琐。严格的内标则是在反应管中加入一定含量的内标模板，通过内标含量的变化来监控整个PCR过程。

大肠杆菌噬菌体MS2是包膜蛋白包裹结构的RNA结构，与RNA病毒相似，且MS2无致病性，可快速培养。将大肠杆菌噬菌体MS2作为RNA的RT-PCR检测的内标质控品的研究具有重要意义。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品的制备方法。

具体技术方案如下：

一种大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品的制备方法，包括以下步骤：

(1)宿主菌的制备：挑大肠杆菌ATCC15597菌种接种在固体培养基上培养；再挑取单菌落接种至液体培养基中，扩大培养，得到含宿主菌的培养液；

(2)噬菌体MS2单克隆的制备：挑噬菌体MS2用双层琼脂平板培养法培养18-24小时，再挑取单个噬菌斑至含宿主菌的液体培养基中培养20-24h，得到含噬菌体MS2的培养液；

(3)噬菌体MS2的扩大培养：将步骤(1)制备的含宿主菌的培养液接种到液体培养基中，培养4-5小时，得到细菌培养液，再将步骤(2)制备的含噬菌体MS2的培养液接种到细菌培养液中，培养过夜，取培养液离心，收集上清液，过滤即得到纯化的噬菌体MS2悬液；

(4)噬菌体MS2的分析检测：取步骤(3)制备的噬菌体MS2用荧光RT-PCR法检测Ct值，并用双层琼脂法测效价；

(5)噬菌体MS2内标质控品的制备：用冻干稀释液将噬菌体悬液稀释至Ct值为18-20，分装于离心管中，真空冷冻干燥，将所得冻干品冷冻保存。

在其中一个实施例中，步骤(4)所述荧光RT-PCR法检测Ct值针对噬菌体MS2的扩增引物为SEQIDNO:4和SEQIDNO:5。

在其中一个实施例中，步骤(4)所述荧光RT-PCR法检测Ct值针对噬菌体MS2的探针为SEQIDNO:6。

在其中一个实施例中，步骤(5)所述冻干稀释液为含有质量分数为0.8-1.2％的牛血清白蛋白和体积分数为45-55％的吐温20的水溶液。

在其中一个实施例中，步骤(5)所述真空冷冻干燥的温度为-50℃，压力为0.2mTorr，所述冷冻保存的温度为-20℃。

本发明的另一目的在于提供一种大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品。

具体技术方案如下：

一种大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品，由本发明上述制备方法制备而成。

本发明的另一目的在于提供上述大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品的应用。

具体技术方案如下:

上述大肠杆菌噬菌体MS2内标质控品在RNA病原体的荧光RT-PCR检测过程中作为内标质控品的应用。

本发明的另一目的在于提供一种RNA病原体荧光RT-PCR检测试剂盒。

具体技术方案如下：