[发明专利]一种1型鸭甲肝病毒VP2重组蛋白、ELISA试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种1型鸭甲肝病毒VP2重组蛋白，其特征在于，所述的1型鸭甲肝病毒VP2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种1型鸭甲肝病毒VP2重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：获取VP2目的片段：确定1型鸭甲肝病毒VP2截断基因酶切位点和特异性引物，所述上游引物为5'-GAATTCACTCCTGTTCTTATGAAGTAGGAGC-3'，下游引物为5'-CTCGAGCCTGATTGTCAAATGGTC-3'，增殖1型鸭甲肝病毒株，提取1型鸭甲肝病毒株的RNA，利用特异性引物进行RT-PCR扩增，得到VP2目的片段；

步骤二：构建重组表达质粒pProEx-HTb-VP2：将所述VP2目的片段克隆至pMD19-TSimple载体中，加入连接酶，得到连接产物I，将所述连接产物I转化至感受态细胞中培养，筛选出阳性克隆体，经鉴定后得到重组质粒pMD19-T Simple-VP2，将所述重组质粒pMD19-TSimple-VP2和表达质粒pProEx-HTb的菌株扩大培养后提取质粒DNA，分别用EcoR I和Xho I双酶切、纯化回收，将回收得到的VP2目的片段和载体片段pProEx-HTb连接，得到连接产物II，将所述连接产物II转化至感受态细胞中培养、筛选出阳性克隆，经鉴定后得到重组表达质粒pProEx-HTb-VP2；

步骤三：制备VP2重组蛋白：重组表达质粒pProEx-HTb-VP2转化至大肠杆菌BL21中，进行重组蛋白诱导表达，结束后纯化、鉴定，得到1型鸭甲肝病毒VP2重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP2重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，VP2目的片段与所述pMD19-T Simple载体的物质的量之比为6:1，取5μL所述连接产物I加入50μL感受态细胞E.coli DH5α，吹打混匀，冰浴30min后42℃热击60～90s，冰浴1min，加入LB液体培养基450μL，37℃摇床1.5h后，经Amp抗性LB固体和液体培养基筛选阳性克隆。

4.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP2重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，所述回收得到的VP2目的片段与载体片段pProEx-HTb的物质的量之比为6:1，取5μL所述连接产物II加入50μL感受态细胞E.coli DH5α，吹打混匀，冰浴30min后42℃热击60～90s，冰浴1min，加入LB液体培养基450μL，37℃摇床1.5h后，经Amp抗性LB固体和液体培养基筛选阳性克隆。

5.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP2重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，所述重组质粒pMD19-T Simple-VP2和重组表达质粒pProEx-HTb-VP2的鉴定方法均包括菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定，选取所述菌液PCR鉴定正确的阳性菌液提取质粒DNA，对提取的所述质粒DNA用EcoR I和Xho I进行双酶切鉴定，选取经菌液PCR和双酶切鉴定均正确的菌株进行所述测序鉴定。

6.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP2重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白诱导表达条件为：IPTG浓度为0.2～1.0mM/L诱导8～10h、温度为37℃。

7.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP2重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤三中纯化方法为切胶纯化方法。

8.一种用于检测1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，包括ELISA板、PBST缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色液以及终止液，所述ELISA试剂盒还包括权利要求1所述的1型鸭甲肝病毒VP2重组蛋白。