[发明专利]一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位及其鉴定方法和应用

权利要求书

1.一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示或SEQ ID NO:5所示。

2.权利要求1所述一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白B细胞表位的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：获取VP3目的片段：确定1型鸭甲肝病毒VP3截断基因酶切位点和特异性引物，上游引物为5'-GGATCCGCAATGGACAATCAGGGAAAGAGA-3’，下游引物为5'-CTCGAGAACTGGCTAATCATCCCCTA-3’；增殖DHAV-1病毒株，并提取DHAV-1病毒株的RNA，利用随机引物对1型鸭甲肝病毒的RNA为模板进行cDNA合成后以特异性引物进行PCR扩增，得到VP3目的片段；

步骤二：构建重组表达质粒pGEX-VP3：将所述VP3目的片段T-A克隆至pMD19-T(Simple)载体中，构建重组T质粒pMD19-VP3，用BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切空质粒pGEX-4T-1和鉴定正确的阳性重组质粒pMD19-VP3，回收、连接、鉴定，得到重组表达质粒pGEX-VP3；

步骤三：制备VP3重组蛋白：将所述重组表达质粒pGEX-VP3转化至大肠杆菌BL21 DE3中，进行重组蛋白诱导表达，结束后，将菌液纯化、鉴定，得到1型鸭甲肝病毒VP3重组蛋白，所述VP3重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

步骤四：制备VP3重组蛋白多克隆抗体，检测血清效价并鉴定多克隆抗体的特异性；

步骤五：测定DHAV-1病毒对鸡胚或鸭胚的半数致死量ELD₅₀；

步骤六：测定VP3重组蛋白多克隆抗体的中和效价；

步骤七：VP3蛋白上B细胞抗原表位鉴定：预测VP3蛋白B细胞抗原表位，人工合成表位肽，以VP3重组蛋白多克隆抗体和阴性血清进行间接ELISA。

3.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白B细胞表位的鉴定方法，其特征在于，所述VP3重组蛋白多克隆抗体制备步骤包括：以纯化的VP3重组蛋白免疫雄兔制备抗血清，用琼脂扩散试验检测最后一次免疫后7d的血清效价，获得VP3重组蛋白多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白B细胞表位的鉴定方法，其特征在于，所述免疫的程序包括：首免用0.5mg的VP3重组蛋白溶液与等体积弗氏完全佐剂乳化为油包水状态后，颈背部皮内、皮下注射兔子；首免后11天用1mg的VP3重组蛋白溶液与等体积弗氏不完全佐剂乳化为油包水状态后，在兔子的颈背部皮下注射进行二免；二免后22天用1mg的VP3重组蛋白与等体积弗氏不完全佐剂乳化为油包水状态后，颈背部皮下注射兔子进行三免；首免后34和47天，用0.5mg的VP3重组蛋白耳缘静脉注射兔子进行四免和五免。

5.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白B细胞表位的鉴定方法，其特征在于，所述测定DHAV-1病毒对鸡胚的半数致死量ELD₅₀步骤包括：将DHAV-1弱毒株的病毒液作连续10倍稀释并接种9日龄鸡胚尿囊腔，对接种后的鸡胚每天照蛋观察，统计各组鸡胚死亡情况，采用Reed-Muench法计算病毒液的ELD₅₀。

6.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白B细胞表位的鉴定方法，其特征在于，所述测定VP3重组蛋白多克隆抗体的中和效价步骤包括：用测过ELD₅₀的DHAV-1弱毒株的病毒液，按固定病毒-稀释血清法测定VP3重组蛋白多克隆抗体的中和效价，运用Reed-Muench法计算其中和效价。