[发明专利]一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位及其鉴定方法和应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位及其鉴定方法和应用，其鉴定方法包括以下步骤：获取VP3目的片段、构建重组表达质粒pGEX‑VP3、制备VP3重组蛋白、制备VP3重组蛋白多克隆抗体、测定DHAV‑1病毒对鸡胚或鸭胚的半数致死量ELD₅₀、测定VP3重组蛋白多克隆抗体的中和效价、VP3蛋白上B细胞抗原表位鉴定。本发明综合运用生物信息学软件预测了VP3蛋白的线性B细胞表位并人工合成表位肽，结合间接ELISA方法对人工表位肽进行了鉴定，可为后续DHAV‑1免疫学研究的深入开展、建立新型诊断制剂和开发多肽疫苗提供参考。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位及其鉴定方法和应用。

背景技术

鸭肝炎又名鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)，是由鸭肝炎病毒(Duckhepatitis virus，DHV)引起的一种高度接触性和致死性的鸭病毒性传染病，其特征为发病急、传播快、病程短、病死率高，病鸭剖检可见肝肿大、表面呈树枝状充血或出血性斑点，该病最早于1945年发现于美国。DHV最初分三个血清型(DHV-1，DHV-2和DHV-3)，后来DHV-2和DHV-3被划归星状病毒科，三个血清型之间无抗原相关性。现在DHV-1已被命名为鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)，归为小RNA病毒科的禽肝炎病毒属(Avihepatovirus)，包含三个基因型(DHAV-1、2和3)，其中1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)是分布最广、危害最大的鸭甲型肝炎病毒。DHAV可在鸭胚、鸡胚和鹅胚的绒毛尿囊腔内增殖，也可经鸡胚胎成纤维细胞、鸡胚胎肾细胞、鸭胚胎成纤维细胞、鸭胚胎肝细胞、鸭胚胎肾细胞等多种细胞培养。DHAV抵抗力强，对常见的病毒灭活剂和消毒剂有较显著的抵抗力，且能耐受pH3.0的酸性环境，对热也有较强抵抗力。细胞培养物中的DHAV在50℃的半衰期为48min，一定浓度的NaCl、Na₂SO₄、MgCl₂或MgSO₄可防止病毒在50℃失活，但62℃30min可使其全部灭活。感染鸡胚液中的病毒于4℃可存活半年，置-20℃则能保持活力达9年之久。自然环境中，病毒可在未清洗的污染孵化器内可存活至少10w，在阴凉处的湿粪中可存活37d以上。DHAV可致雏鸭常年发病(自然状态下)，且可在感染后3～4d内死亡。成年种鸭感染后无临床症状，且不影响其产蛋性能。病毒主要通过消化道排出体外，然后又通过食物或饮水经呼吸道和消化道再次感染，病鸭、成年带毒鸭及康复鸭是主要的带毒体，可以通过粪便排毒，引起其他易感鸭群的感染，该病毒不经过卵垂直传播给后代，但明显可以在鸭群中水平传播。该病毒对雏鸭的致死率很高，1周龄以内的雏鸭死亡率高达95％，1～3周龄内死亡率降至50％以下，到4～5周龄死亡率会更低一些。

抗原表位是发挥抗原分子抗原性的结构和功能单位，它们为小的短肽，一般不超过20aa。从结构上可分为线性表位和构象型表位，线性表位既有T细胞表位也有B细胞表位，而构象型表位却是B细胞表位所特有的。B细胞表位上的特定位点能被B淋巴细胞特异性识别并结合，诱导机体体液免疫应答，从而有效清除病原。对抗原表位的研究是疾病诊断、定点改造蛋白类生物制品以及预防、治疗疾病的基础，尤其是目前表位疫苗的研究，都是以表位研究为基础。

目前，国内外研究抗原表位的方法主要有单克隆抗体技术、噬菌体展示技术、裂解法、交互重叠多肽法、肽芯片高通量扫瞄法等，诸多试验结果显示，单独或者综合利用以上技术开展抗原表位研究是可行的。随着生物信息学技术的发展，目前B细胞表位的研究可更多借助于软件预测，而且其准确性也越来越高。绝大多数B细胞表位的预测都是以一级结构为基础，而对构象表位预测的准确性却不及线性表位。综合亲水性、柔性、表面可及性、抗原性及二级结构可分析预测线性B细胞表位，VP3是小RNA病毒主要的结构蛋白，众多研究已经证明小RNA病毒的VP3蛋白上存在众多的B细胞表位，而DHAV的VP3蛋白的B细胞表位却尚未见研究和证实的报道，理论上推测，其VP3蛋白上也会存在大量B细胞表位，因此挖掘其表位信息具有研究价值。