[发明专利]一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组，其特征在于，包括引物对V.pa、引物对N.se和引物对P.da；其中，所述引物对V.pa包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的V.pa-F和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的V.pa-R；所述引物对N.se包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的N.se-F和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的N.se-R；所述引物对P.da包括核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的P.da-F和核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的P.da-F。

2.一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述检测引物组。

3.根据权利要求2所述副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测试剂盒，其特征在于，还包括蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70％的乙醇、TE缓冲液、CTAB的NaCl溶液、阳性对照品和PCRDsMix；所述酚-氯仿-异戊醇混合溶液中酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1；所述CTAB的NaCl溶液为将CTAB溶于0.5mol/L的NaCl溶液中，CTAB和所述NaCl溶液的质量体积比为1:20；所述阳性对照品包括副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的DNA模板。

4.根据权利要求3所述副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测引物组中的引物浓度均为10μM。

5.根据权利要求3所述副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL，所述SDS溶液的质量浓度为10％。

6.根据权利要求3所述副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测试剂盒，其特征在于，所述PCRDsMix为2×PCRDsMix。

7.采用权利要求2～6任一所述检测试剂盒进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取待检测样品50～100mg并加入500～550μL的TE缓冲液，用玻璃匀浆器充分匀浆后，于12000r/min离心10min；

2)步骤1)离心后去除沉淀，取上清备用；

3)向步骤2)上清溶液中加入30μL质量浓度为10％的SDS溶液和15μL20mg/mL的蛋白酶K，并于37℃温育1h；

4)向步骤3)温育后的溶液中加入100μL5mol/L的NaCl溶液,充分混匀后再加入80μLCTAB的NaCl溶液，65℃温育20min；

5)向步骤4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶液混匀，12000g/min离心4～5min；

6)将步骤5)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0.6～0.8倍体积的异丙醇，12000g/min离心4～5min；

7)步骤6)离心后去上清，沉淀用1mL的体积浓度为70％的乙醇洗涤后，12000g/min离心4～5min；

8)步骤7)离心后去上清，沉淀常温干燥5～10min，重溶于30～50μLTE缓冲液，即为样品DNA模板；

9)样品组三重PCR反应体系包括：12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物V.pa-F、0.8μL引物V.pa-R、1.2μL引物N.se-F、1.2μL引物N.se-R、1.6μL引物P.da-F、1.6μL引物P.da-R、3μL步骤8)得到的样品DNA模板和2.3μL无菌水；

10)阳性对照组三重PCR反应体系包括：12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物V.pa-F、0.8μL引物V.pa-R、1.2μL引物N.se-F、1.2μL引物N.se-R、1.6μL引物P.da-F、1.6μL引物P.da-R、3μL阳性对照品和2.3μL无菌水；

11)将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后12000g/min离心10s，置于PCR仪中，分别于94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，进行PCR反应；

12)对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测，分别设置样品孔、阳性对照孔和参比孔；所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述参比孔取5μLDL2000DNAMarker加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；以140V电压分别对所述样品孔、所述阳性对照孔和所述参比孔进行电泳20min后，于凝胶成像系统下观察结果；若样品孔电泳条带出现与阳性对照孔相同大小的条带，则说明待测样品中含有相对应的细菌。