[发明专利]一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖动物病原菌检测领域，具体涉及一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。

背景技术

副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)、美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamsel)和鰤诺卡氏菌(Nocardiaseriolae)是三种常见的水产病原菌，其中副溶血弧菌和美人鱼发光杆菌属于革兰氏阴性菌，而鰤诺卡氏菌属于革兰氏阳性菌，这三种菌在海洋环境及水产养殖环境中广泛分布，可引起多种水产养殖动物大量死亡，造成严重的经济损失。

副溶血弧菌具有嗜盐性，可经粪-口途径传播。食用生鲜或未加工的海产食品，尤其是牡蛎，非常容易患由副溶血弧菌引起的急性肠胃炎。副溶血弧菌的爆发往往集中在沿海地区的夏季和初秋，因为这个时间段水温较高进而细菌含量更高。我们最常食用的海鲜包括乌贼、鲭鱼、金枪鱼、沙丁鱼、蟹、虾、牡蛎和蛤蚌等都容易携带副溶血弧菌。美人鱼发光杆菌具有嗜盐性，其重要致病因子是胞外蛋白酶类、胞外溶血素和细胞溶素等，现已从多种鱼类、爬行动物、软体动物和甲壳动物中分离到美人鱼发光杆菌，此菌严重威胁水产养殖重要经济品种。诺卡氏菌为属兼性细胞内病原，广泛分布在土壤、活性污泥、水、动植物和人的组织中，以腐生为主，可引发人、牛、猫、犬等哺乳动物及多种水产养殖动物疾病，已经成为一种引人注目的人-兽-鱼共患病病原。

凡纳滨对虾以其肉味鲜美，适应性强、生长迅速和抗病力强等优点，成为当今世界养殖产量最高的对虾养殖品种之一。2013年我国海水养殖虾类产量约为108万吨，其中南美白对虾产量约为81万吨，占总产量75％。然而随着养殖密度的增加及养殖环境的恶化，对虾病害日益严重。2014年对虾肝胰腺坏死症(AHPNS)席卷全球对虾产区，根据实验表明，每一尾病虾会吸引57尾健康虾的蚕食，疾病1传57，致死率可达100％。研究发现AHPNS并不是单一某种细菌造成的，而是由综合细菌引起的，并且与副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和诺卡氏菌有着密切的关联。目前养殖户采用混养模式来预防AHPNS病害，通过凡纳滨对虾与不同鱼类混养的方式，利用它们在食物链中的不同作用，及时清理病虾和死虾，降低病原传播、减少病害发生，提高养殖成功率及产量。然而这种方法并没有能从本质上去判断对虾是否患有AHPNS疾病，采用这种方法降低病原传播的概率并不高，仍可能遗漏一些患病的对虾在水域中而未被鱼类所清理，进而仍存在对其他健康对虾的传染性隐患，而且该方法存在对虾和鱼交叉感染的概率，因此存在着一些不足。

PCR技术是一种通过体外酶促反应放大扩增特定的基因的技术，该技术能将微量的DNA大幅增加，具有检测灵敏度高的特点，而多重PCR方法是PCR技术的重要分支，可检测多种特异性基因片段。三重PCR在普通PCR的基础上，在同一反应体系中加入三对引物，进而同时特异性扩增出三种目的基因片段，这样操作节省时间和成本。如何建立三重PCR方法用于快速检测副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌具有重要的实际意义和应用价值。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组，使其可用于三重PCR检测方法中，用以检测样品是否感染有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌。

本发明所要解决的技术问题还有：如何提供一种检测试剂盒和检测方法，用以直接检测样品是否感染有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌，且具有精确度高、检测方便的特点。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组，包括引物对V.pa、引物对N.se和引物对P.da；其中，所述引物对V.pa包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的V.pa-F和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的V.pa-R；所述引物对N.se包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的N.se-F和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的N.se-R；所述引物对P.da包括核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的P.da-F和核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的P.da-F。

一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测试剂盒，包括上述检测引物组。

采用上述检测试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：

1)取待检测样品50～100mg并加入500～550μL的TE缓冲液，用玻璃匀浆器充分匀浆后，于12000r/min离心10min；

2)步骤1)离心后去除沉淀，取上清备用；