[发明专利]一种利用海藻酸钠水凝胶制备细胞膜片的方法

说明书

本发明公开了一种可以用来构建细胞片层（cell sheet）的基底材料及利用其制备细胞膜片的方法。首先利用冷冻干燥及添加制孔剂的方法将海藻酸钠制成膜片，为了引入必要的反应基团，海藻酸钠需要经过化学改性，利用生物大分子对海藻酸钠基底表面或本体进行改性，即可用于接种细胞。最后在基底材料上接种细胞之后，通过培养环境的调控，促使细胞增殖及产生大量细胞外基质，以形成完整的细胞膜片，再使用一定浓度的柠檬酸钠溶液对基底材料海藻酸钠进行溶解，获得完整的具有良好生物学性能的细胞膜片。本发明上述技术具有底物可溶解、适用于大量细胞、操作简单、成本低的特点，避免了传统方法对细胞造成的影响，而且生物相容性好。

技术领域

本发明属于组织工程领域。更具体地，涉及一种利用海藻酸钠水凝胶制备细胞膜片的方法。

背景技术

构建组织工程材料具有三个要素，即种子细胞、支架材料、细胞因子。传统组织工程材料的构建时，在获取种子细胞的过程中通常需要胰蛋白酶或者蛋白水解酶的消化，从而获得细胞悬液，但是胰蛋白酶和蛋白水解酶在一定程度上对细胞造成损害，会导致细胞大量损失且活性低，这也是许多细胞随着传代次数增加形态发生改变并逐渐衰老的原因之一。同时，细胞与支架材料直接复合，细胞利用率低，难以形成致密骨组织。而且还会使细胞的Na+/K+-ATP酶、葡萄糖转运蛋白酶-1（glucose transporter-1,GLUT-1）、钠-葡萄糖共转运载体（sodium glucose cotransporter-1,SGLT-1）、水通道蛋白等受到不同程度的破坏与损伤，不利于其在指甲上粘附以及分泌细胞外基质。为了解决种子流失问题，研究者们提出了一种种子细胞接种新技术--细胞膜片技术（cell sheet technology，CST）。

国内外学者对细胞膜片技术在组织工程方面进行了深入的研究，制备的细胞膜片作为组织工程材料，与传统的材料制品相比具有以下特点：首先，满足了理想组织工程细胞支架的条件；同时，该细胞片层不仅具有适于细胞增殖、分化和粘附的三维空间结构；并且，具备良好组成成分，有无毒、无副作用，具有良好生物相容性；最后，它在一定程度上促进促进血管生成，促进宿主干细胞的迁移和分化等。应用细胞片层技术获得的种子细胞，既保留了细胞与细胞之间的结构又保留了细胞分泌的细胞外基质（extracelluar mix，ECM），而ECM是细胞环境的一种重要组成部分，细胞分泌的各种ECM成分形成基质间质和基质膜，因为该组织适合细胞生长故能促使细胞在体内细胞锚定在该构架上。

细胞膜片技术最早由Okano提出，他通过运用N-异丙基丙烯酰胺这种温度敏感的表面作为细胞片层。与此同时，通过表面自主装烷硫醇或者短肽，之后通过电化学方法分离，或者运用一种非蛋白水解酶的酶类，再通过简单方法水解该酶水解等等。温度反应性细胞片层技术应用较为广泛，它利用温度反应性培养皿培养细胞，在37 ℃的培养条件下，培养基底部聚合物的表面呈疏水性，细胞可在培养皿底部增殖，但当温度降低至临界温度32℃以下时，聚合物表面由疏水性变为亲水性，并在培养皿底部与培养的细胞之间形成水化层，使细胞呈层状完整的从培养皿底部分离。

但是，目前的CST主要通过对温度敏感的表面养细胞之后改变温度使基地和细胞分离开，或者通过表面修饰特殊的蛋白来实现，存在技术操作复杂等缺陷，与其他组织工程方法一样，应用细胞膜片技术进行组织重建时，种子细胞的获取比较困难；叠加的细胞片层超过一定厚度时，常导致内部细胞的坏死；应用细胞膜片技术构建大的功能性组织结构仍是细胞膜片技术面临的一大难题，限制了其推广应用。因此，探索一种不使用酶解方法、且操作简单方便的获得细胞膜片的技术显得尤为重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有细胞膜片技术的缺陷和不足，探索一种利用表面改性的海藻酸钠基底材料为基底制备细胞膜片的新方法，该技术不仅具有常规CST的优点，重要的是其底物可溶解，且对细胞无特殊要求，适用于大量细胞等特点；与此同时，该技术操作简单方便，成本低，无需大型设备。利用该技术制备细胞片层，应用细胞片层叠加构建三维结构的组织以及细胞片层结合支架的方法构建三维结构的组织，与传统的组织工程学方法结合必定会促进组织工程学的发展。