[发明专利]一种基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法。

背景技术

百合是百合科百合属的多年生草本球根植物，原产于中国，主要分布在亚洲东部、欧洲、北美洲等北半球温带地区，全球已发现有至少120个品种，其中55种产于中国。近年更有不少经过人工杂交而产生的新品种，如亚洲百合、香水百合、火百合等。鳞茎含丰富淀粉，可食，亦作药用。百合鲜食干用均可。百合是中国传统出口特产。

百合从古至今都是受人们喜爱的世界名花，百合花姿雅致，叶片青翠娟秀，茎干亭亭玉立，是名贵的切花新秀，在中国百合具有百年好合美好家庭、伟大的爱之含意，有深深祝福的意义。

百合现有的繁殖方法在生产上主要有鳞片繁殖、籽球繁殖和珠芽繁殖3种，具有繁殖效率慢，成球率较低或小鳞茎生根数量较少，繁殖系数低，且易受自然条件限制的缺点，随着生物技术的发展，组织培养技术在一定程度上提高了繁殖效率，但仍具有操作复杂、成本投入大、污染率等缺点。不能满足遗传转化过程中的大批量需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种转化周期短、污染率低、成本低、操作简便的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法。

一种基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，包括如下步骤：

(A)在第一液体培养基中进行农杆菌培养；

(B)进行菌液的离心，收集菌体，采用第二液体培养基重新悬浮菌体；

(C)取洗净的百合鳞片浸没于重悬后的菌体中，取出百合鳞片，将其基部浸入所述第二液体培养基中，进行黑暗培养，即共培养；

(D)取出共培养后的百合鳞片，置于喷雾式植物反应器中，进行百合鳞茎芽诱导，采用喷淋溶液对百合鳞茎进行喷淋处理，获得诱导的小鳞茎；

(E)将诱导的小鳞茎进行移栽，进行转基因植株的筛选。

本发明所述的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，其中，步骤(A)中所述第一液体培养基为LB+Rifamycin50mg/L+Km50mg/L，体积为250mL，培养条件为：28℃，200rpm，OD600＝0.6-1.0之间。

本发明所述的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，其中，步骤(B)中所述菌液在6000rpm条件下进行离心，收集菌体，用1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+As0.2mg/L重新悬浮菌体，至OD600＝0.6-1.0之间。

本发明所述的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，其中，步骤(C)为共培养过程，具体包括如下步骤：

取洗净的百合鳞片浸没于重悬后的菌体中15分钟，取出百合鳞片后将其置于培养容器中，所述培养容器包括培养盘和与其匹配的盘盖，所述培养盘由深色塑料制成，包括盘底和4个培养盘侧壁，均为长方形，所述盘盖由透明塑料制成，包括顶板和4个顶板侧壁，均为长方形，所述培养盘和盘盖的规格均为长18.5cm，宽14.5cm，高4.5cm；4个所述培养盘侧壁和4个所述顶板侧壁均压制成瓦楞型以增加强度；

在所述培养盘内的底部铺设有培养基质，所述培养基质的铺设高度为1.5cm，所述培养基质为陶粒或珍珠岩；在所述培养盘内底部还包括1cm高度的第二液体培养基，所述第二培养基为去除糖和铵盐的1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+As0.2mg/L的溶液；

将所述百合鳞茎的基部向下插入固定在所述培养基质中，并使其基部浸没在所述第二培养基内，盖上所述盘盖，于28℃黑暗培养3-5天。

本发明所述的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，其中，步骤(D)具体包括如下步骤：

取出共培养后的百合鳞片，置于喷雾式植物反应器中，采用喷淋溶液喷淋处理，进行百合鳞茎芽诱导；

所述喷淋溶液为含有6-BA5.0和NAA1.0的溶液，设置喷雾控制系统，前15天每天喷雾6次，15天之后每天喷雾4次，每次2min，在每次喷淋结束后等待1min，对喷雾式植物反应器底部的残液进行过滤处理后回收，回收时间2min；13-15天鳞片基部会萌发出不定芽，40-50天即可获得诱导的小鳞茎。

本发明所述的基于喷雾式植物反应器的百合鳞片遗传转化方法，其中，所述喷雾式植物反应器包括第一雾培箱、第二雾培箱、水箱、回收水箱和控制系统：