[发明专利]一种发酵煤渣专用的微生物菌剂及其制备方法

权利要求书

1.一种发酵煤渣专用的微生物菌剂及其制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)煤渣预处理，先将煤渣与膨润土或膨润粘土按比例混合，混合后土壤湿度为55-60％，覆上塑料薄膜，在30-60℃下，腐熟30-40天；

2)稀释煤渣样品，称取10g或10ml步骤(1)所得样品，加入90ml无菌水，振荡1h,形成悬独液；取1ml液体加入装有9ml无菌水试管中振荡稀释，10倍系列稀释至10²，最终稀释成10³、10⁴、10⁵、10⁶浓度梯度；

3)分离煤渣分解菌，制备LB固体、MRS固体、麦芽汁固体、高氏一号固体、PDA麸皮固体平板,分别取10³-10⁶各稀释梯度样品0.1mL,进行平板涂布，三组平行；LB固体平板倒置于37℃培养一天，高氏一号平板和PDA麸皮平板于28°C培养一周，MRS固体和麦芽汁固体平板连同厌氧罐一起置于37℃培养。从平板中挑取单菌落进行平板划线分离培养，然后将单菌落保存于相应固体斜面培养基中扩大培养，初步制得煤渣分解菌；

4)煤渣分解菌共培养，挑选LB固体、MRS固体、麦芽汁固体、高氏一号固体、PDA麸皮固体平板上划线分离培养的单菌落接种在共培养培养基进行摇瓶发酵培养，36℃，220rpm,培养36h，得到菌液；

5)煤渣分解菌剂制备，将步骤4)所得的菌液按悬液按体积百分数1-5％的接种量再次转接至共培养培养基，发酵至芽孢浓度为2-5×10¹²CFU/ml芽孢数占所述发酵菌液总菌数的80-85％以上，得到微生物菌剂。

2.根据权利要求1所述的一种发酵煤渣专用的微生物菌剂及其制备方法，其特征在于所述步骤1)煤渣与膨润土或膨润粘土按比例混合为1-2:1-3。

3.根据权利要求1所述的一种发酵煤渣专用的微生物菌剂及其制备方法，其特征在于所述步骤3)高氏一号平板和PDA麸皮平板含有过滤除菌的50ug/ml的氯霉素。

4.根据权利要求1所述的一种发酵煤渣专用的微生物菌剂及其制备方法，其特征在于所述步骤4)共培养培养基组分是硫酸铵2-3g，葡萄糖3-5g，马铃薯淀粉7-8g，磷酸氢二钾0.3-0.4g,氯化钠0.2-0.4g,硫酸镁0.8-1.0g,硫酸猛0.03-0.05g,硫酸亚铁0.03-0.05g,酵母粉3-5g,蒸馏水1000ml，调节PH7.0，然后121℃，灭菌15min制备而成。