[发明专利]马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用，提供了：分离的多核苷酸，其序列如SEQ ID NO:1、2所示；载体，含有SEQ ID NO:1或2所示的多核苷酸；重组载体，含有如SEQ ID NO:7所示的序列；马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体，是以pEarleyGate 303为骨架载体，在重组位点处置换插入顺序连接的EcoR I、AsiS I、PRBCS3B启动子、Not I、SEQ ID NO:1的序列、Sbf I、RBCS3B的第2个内含子、BbvC I、SEQ ID NO:1的反向互补序列、Asc I、TRBCS3B终止子、EcoR I。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种RNAi表达载体及其构建方法和应用，尤其涉及一种马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)属鞘翅目，叶甲科，是世界著名的毁灭性检疫害虫，原产在美国，后传入法国、荷兰等一些国家，现已广泛分布于欧美和亚洲的40多个国家，是中国外检对象。寄主主要是茄科植物，大部分是茄属，其中马铃薯是最适寄主，此外还可危害番茄、茄子、辣椒、烟草等。马铃薯甲虫是一种分布最广、为害最甚的马铃薯害虫，成虫和幼虫常常将马铃薯的叶片全部吃光，造成马铃薯减产30-50％，最严重的地方甚至减产90％左右。现在主要的防治措施还是通过喷洒化学农药，然而，一方面，化学农药的大量使用导致害虫产生了抗药性；另一方面，农药残留直接危害自然环境和人类的健康。虽然马铃薯甲虫传入我国才20年左右，但马铃薯甲虫抗药性水平发展很快，研究表明发生区大部分马铃薯甲虫种群对拟除虫菊酯类(三氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯)杀虫剂普遍产生中到极高水平的抗性。因此，积极开展马铃薯甲虫生物防治技术的研究与应用，对我国发生区马铃薯甲虫的危害实施科学有效控制，以及延缓其抗药性产生和抗药性治理具有十分重要作用。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象，具有高效、特异、易操作等特点。由于使用RNAi技术可以特异性关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。通过基因干涉来防治马铃薯甲虫具有绿色、环保、可持续、经济有效等特点，有利于保护人们生命健康，由于RNAi具有高度的特异性，对非靶标基因或同源性不高的基因没有效果，具有极高的种间特异性，不危害人类的生命安全。

TOR(Target of Rapamycin)是一种进化中保守的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，在酵母、动物、植物中通过整合营养和能量信号来促进细胞的增殖和生长。TOR信号通路在动物胚胎形成、分生组织激活，植物根和叶的生长、开花、衰老和生命周期的控制中都扮演着关键作用。近几年研究发现，TOR还具有调节核糖体的生物合成、促进翻译、新陈代谢调节和抑制自噬的功能。在模式动物线虫、果蝇和小鼠中，TOR基因的缺失能够导致动物胚胎致死，说明TOR基因是动物体内的必须基因，在动物的生长发育进程中扮演着核心作用。构建TOR基因的RNAi载体来干扰马铃薯甲虫的TOR基因在马铃薯甲虫中还没有被研究过。

发明内容

本发明的目的是提供马铃薯甲虫TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。提供另一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有SEQ ID NO:1或2所示的多核苷酸。