[发明专利]铜绿假单胞菌的PSR检测方法及其专用引物与试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及细菌的分子生物学检测方法，特别是涉及铜绿假单胞菌的PSR检测方法及其专用引物与试剂盒。

背景技术

铜绿假单胞菌的学名是Pseudomonasaeruginosa，是一种常见的条件致病菌，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。

本菌为专性需氧菌，生长温度范围25～42℃，最适生长温度为25～30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素(pyocynin)与带荧光的水溶性荧光素(pyoverdin)等。在血平板上会有透明溶血环。

该菌含有O抗原(菌体抗原)以及H抗原(鞭毛抗原)。O抗原包含两种成分：一种是其外膜蛋白，为保护性抗原；另一种是脂多糖，有特异性。O抗原可用以分型。

经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。铜绿假单胞菌引起的很多感染发生在衰弱或免疫受损的住院病人，它是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌，是呼吸机相关性肺炎的常见原因。除医院内获得感染外，HIV感染者很容易在社区获得该菌的感染，而且一旦被铜绿假单胞菌感染，常可出现晚期HIV感染的体征。

聚合酶螺旋反应(PolymeraseSpiralReaction，PSR)是一种全新的核酸恒温体外扩增方法(Liu,W,DongD,YangZ,ZouD,ChenZ,YuanJ,HuangL.PolymeraseSpiralReaction(PSR):Anovelisothermalnucleicacidamplificationmethod.Sci.Rep.2015,5,12723.)，这种方法通过在两条引物的5’端加上一段互为反向的序列，可以使引物以自我为模板采用自螺旋扩增的方式将目标核酸片段大量扩增出来。只需要两条引物，在大片段DNA聚合酶的作用下，恒温60℃-65℃保持30-120分钟，便可以将靶序列大量扩增出来，仅需要两条引物且不需要热循环便可以大量扩增靶序列是PSR的显著特点。同时也可以通过添加两条加速引物来大大加速扩增反应的进程，可以使扩增时间缩短至20-30分钟以内，特别适合床头检测和现场的快速检测。整个PSR反应只需要一种酶，大大简化了操作，使成本也大大降低。由于仅需要两条引物，所以对靶序列的要求也大大减少，特别适合于一些变异较大的病毒的快速检测。在设计引物的时候引入了外源序列，这样的话就增加了对扩增产物操作的可能性，可以把扩增产物用于杂交、标记、示踪等各种修饰应用。但是迄今为止，市场上还未见用于检测铜绿假单胞菌的PSR专用引物与试剂盒问世。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于检测铜绿假单胞菌的聚合酶螺旋反应引物。

本发明提供的成套引物，其由引物1、引物2、引物3、和引物4组成；

所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列2、序列3、序列4和序列5。

上述引物中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为2：2：1：1。

本发明另一个目的是提供用于检测铜绿假单胞菌的聚合酶螺旋反应试剂。

本发明提供的反应试剂，包括上述引物。

上述聚合酶螺旋反应试剂由DNA聚合酶、Tris·HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、Tween20、甜菜碱、Mg²⁺、dNTPs、上述的引物和水组成；

所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4在所述聚合酶螺旋反应试剂中的浓度分别为40pmol/ul、40pmol/ul、20pmol/ul和20pmol/ul。

本发明第三个目的是提供用于检测铜绿假单胞菌的聚合酶螺旋反应试剂盒。

本发明提供的试剂盒，其包括上述的引物或上述的聚合酶螺旋反应试剂。

为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为铜绿假单胞菌的DNA，所述阴性对照为不含DNA的PSR扩增体系(如双蒸水)。