[发明专利]羊抗兔β防御素104a多克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种羊抗兔β防御素104a多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

β防御素104a是一种在羊附睾头高度特异性表达的防御素，需要有特定的抗体研究其蛋白的表达定位特点及其生物学功能，然而，目前还未见有可用于绵羊和山羊的β防御素104a多克隆抗体。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种羊抗兔β防御素104a多克隆抗体及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

羊抗兔β防御素104a多克隆抗体，它的核苷酸序列为

TGTTTGAAAAGGTGGAATGTCAACTCACTGAATCCTCAGAAGGAC

本发明还提供了上述羊抗兔β防御素104a多克隆抗体制备方法，包括如下步骤：

S1、将β防御素104a蛋白N端55-69共15个氨基酸作为羊抗兔β防御素104a多克隆抗体的抗原表位，合成羊β防御素104a多肽，纯度＞75％。

S2、取步骤S1所得的1.5mgβ防御素104a多肽偶联到KLH，脱盐后作为免疫原备用；

S3、采用AbMax标准程序(42天)，使用免疫原KLH-CLKRWNVNSLNPQKD多肽免疫兔子，采用步骤S2所得的免疫原进行若干次加强免疫，多肽-BSA的多抗效价达到标准：血清滴度≥1∶50000，第28天每只放血20ml并加强免疫，若动物无异常情况，则在第42天终放血，得羊抗兔β防御素104a多克隆抗体。

其中，所述抗原表位的氨基酸序列为CLKRWNVNSLNPQKD。

上述抗体可以用于山羊和绵羊的免疫组织化学、免疫荧光化学和WesternBlotting检测，用于免疫组织化学时浓度为1∶100-500；用于细胞免疫荧光化学时，浓度为1∶50-200；用于Westernblotting时，浓度为1∶500-1000。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

羊抗兔β防御素104a多克隆抗体，它的核苷酸序列为

TGTTTGAAAAGGTGGAATGTCAACTCACTGAATCCTCAGAAGGAC

本发明还提供了上述羊抗兔β防御素104a多克隆抗体制备方法，包括如下步骤：

S1、将β防御素104a蛋白N端55-69共15个氨基酸作为羊抗兔β防御素104a多克隆抗体的抗原表位，所述抗原表位的氨基酸序列为CLKRWNVNSLNPQKD，合成羊β防御素104a多肽，纯度＞75％。

S2、取步骤S1所得的1.5mgβ防御素104a多肽偶联到KLH，脱盐后作为免疫原备用；

S3、采用AbMax标准程序(42天)，使用免疫原KLH-CLKRWNVNSLNPQKD多肽免疫兔子，采用步骤S2所得的免疫原进行若干次加强免疫，多肽-BSA的多抗效价达到标准：血清滴度≥1∶50000，第28天每只放血20ml并加强免疫，若动物无异常情况，则在第42天终放血，得羊抗兔β防御素104a多克隆抗体。

上述抗体可以用于山羊和绵羊的免疫组织化学、免疫荧光化学和WesternBlotting检测，用于免疫组织化学时浓度为1∶100-500；用于细胞免疫荧光化学时，浓度为1∶50-200；用于Westernblotting时，浓度为1∶500-1000。

ELISA检测抗血清效价

将0.5mgβ防御素104a多肽偶联到BSA，脱盐后作为检测抗原备用。在免疫后的第25天取血，用β防御素104a多肽和多肽-BSA包板(100ng/well)，进行ELISA评价，ProteinG纯化抗体识别肽-BSA滴度达0.005ug/ml。

多克隆抗体亲和纯化与评价

用1mgβ防御素104a多肽制备免疫亲和柱，选择信号较好的兔血，进行免疫亲和纯化10-30ml血清，获得1-3mg免疫亲和纯化抗体。用β防御素104a多肽和多肽-BSA包板(100ng/well)，通过ELISA初步评价免疫亲和纯化后抗体效价，亲和纯化抗体识别肽-BSA滴度能达到0.0001ug/ml。

实施例1

用于山羊附睾头组织的免疫荧光化学，稀释比例1∶50。绿色荧光处为β防御素104a强阳性信号区域。

实施例2