[发明专利]人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；

其中，所述三维细胞培养支架是由胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨三者中的至少两种组合制成的。

2.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，获取骨髓间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，获取骨髓间充质干细胞的步骤还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步骤：将原代骨髓间充质干细胞浓度调整至1×10⁶～1×10⁸个/25ml，加入所述培养基进行培养；当细胞生长到融合时，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1：2～1：3比例接种进行传代培养至细胞生长到融合，继续传代至获得第三代骨髓间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，采用三维细胞培养支架进行体外培养的步骤为：取三维细胞培养支架复溶，取第三代骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1×10⁸～1×10¹⁰L^-1细胞浓度与复溶后的三维细胞培养支架共同接种于所述培养基中进行培养。

5.根据权利要求4所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，三维细胞培养支架复溶过程中，还添加有助溶剂。

6.根据权利要求5所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述助溶剂为乙酸或乙醇，且所述助溶剂的质量分数为5％-15％。

7.根据权利要求3或4所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述培养基为血清培养基，且所述血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。

8.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述胶原支架的制备过程，包括以下步骤：

取胶原溶于乙酸溶液中，获得胶原溶胀液；所述胶原溶胀液经真空脱泡处理后，于-5℃～-198℃温度下冷冻0.5～2小时，然后再进行冻干即可。

9.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述纳米晶胶原基骨的制备过程，包括以下步骤：

制备钙磷比为1.0～2.5的溶液，加入Ⅰ型胶原溶液中，离心去上清，冷冻干燥，再加入聚乳酸即复合形成纳米晶胶原基骨三维框架材料。

10.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述脱细胞软骨的制备过程，包括以下步骤：

取关节软骨浸泡于含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，经粉碎、梯度离心制成软骨微丝，经脱细胞处理后，离心冲洗，加入DNA酶和RNA酶消化后，重复离心，收获沉淀物即脱细胞软骨。