[发明专利]人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(Mesenchymaistemcells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势，因此，探讨MSCs体外大量扩增具有深远意义。

目前骨髓间充质干细胞的体外扩增多采用二维培养方式进行的，也有部分采用三维细胞培养支架进行培养，但均是采用单一的三维细胞培养支架，由于单一的三维细胞培养支架存在机械性能弱，不稳固，且生物相容性差等问题，因此，在培养过程中，容易从三维细胞培养支架的三维培养方式转变成二维培养方式，使得骨髓间充质干细胞黏附性差，细胞活性差，且扩增不明显。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中采用单一的三维支架培养骨髓间充质干细胞存在生物相容性较低、细胞黏附性能弱等造成骨髓间充质干细胞扩增率不高、细胞活性差等缺陷，提供一种能够采用两种及以上的三维支架组合来模拟骨髓微环境进行骨髓间充质干细胞的培养方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；

其中，所述三维细胞培养支架是由胶原支架、纳米晶胶原基骨和脱细胞软骨三者中的至少两种组合制成的。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，获取骨髓间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，获取骨髓间充质干细胞的步骤还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步骤：将原代骨髓间充质干细胞浓度调整至1×10⁶～1×10⁸个/25ml，加入所述培养基进行培养；当细胞生长到融合时，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1：2～1：3比例接种进行传代培养至细胞生长到融合，继续传代至获得第三代骨髓间充质干细胞。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，采用三维细胞培养支架进行体外培养的步骤为：取三维细胞培养支架复溶，取第三代骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1×10⁸～1×10¹⁰L^-1细胞浓度与复溶后三维细胞培养支架共同接种于所述培养基中进行培养。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，三维细胞培养支架复溶过程中，还添加有助溶剂。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述助溶剂为乙酸或乙醇，且所述助溶剂的质量分数为5％-15％。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述培养基为血清培养基，且所述血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述胶原支架的制备过程，包括以下步骤：

取胶原溶于乙酸溶液中，获得胶原溶胀液；所述胶原溶胀液经真空脱泡处理后，于-5℃～-198℃温度下冷冻0.5～2小时，然后再进行冻干即可。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述纳米晶胶原基骨的制备过程，包括以下步骤：

制备钙磷比为1.0～2.5的溶液，加入Ⅰ型胶原溶液中，离心去上清，冷冻干燥，再加入聚乳酸即复合形成纳米晶胶原基骨三维框架材料。

在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述脱细胞软骨的制备过程，包括以下步骤：

取关节软骨浸泡于含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，经粉碎、梯度离心制成软骨微丝，经脱细胞处理后，离心冲洗，加入DNA酶和RNA酶消化后，重复离心，收获沉淀物即脱细胞软骨。