[发明专利]一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法

权利要求书

1.一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)根据目标区域设计引物

(1.1)确定目标基因，根据具体种属，以NCBI官方网站基因序列为参考基因确定目标基因所在染色体的具体位置，从而锁定捕获区域；

(1.2)选择SNP区域，界定在目标基因上下游1M范围内，进一步确定SNP区域捕获范围，在SNP位点上下游100bp捕获片段大小为200bp左右，利用引物设计软件或引物专业设计网站进行引物设计，引物设计完成后对引物进行特异性评估，评估合格后进行引物合成；

(2)家系样本及胚胎样本的准备

(2.1)提取家系中患病个体、父本、母本的外周血样本，获得基因组DNA；

(2.2)采集胚胎细胞样本，进行全基因组扩增；

(3)多重PCR扩增，对家系及胚胎样本进行目标区域SNP的捕获；

(4)采用高通量测序平台，对样本进行测序；

(5)数据分析

(5.1)将步骤(4)获得的测序结果去掉接头以及低质量数据，采用比对软件比对到参考基因组；

(5.2)用软件获得目标区域的SNP，所述软件包括但不限于samtoolsmpileup，GATK，FreeBayes，VarScan中的至少一种；

(5.3)SNP过滤：测序深度最低为100×，等位基因杂合度差异最低为10％，除去潜在错误的SNP；

(5.4)筛选区分型SNP，并构建父本和母本SNP-单体型：同一SNP位点，在父本和母本的4个等位基因碱基中，有1个碱基不同于其他3个即可区分；

(5.5)分析SNP-单体型：胚胎SNP-单体型有2个，分别遗传自父本和母本各1条，根据区分型SNP和孟德尔遗传原理，判断其SNP-单体型具体哪个是父源遗传，哪个是母源遗传；

(5.6)结果分析：根据步骤(5.4)确定父本和母本SNP-单体型，区分出与致病位点连锁的单体型，将胚胎所在SNP的具体等位基因对比，根据孟德尔遗传原理，判断胚胎是否携带致病基因位点。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1.2)中所述的引物设计，设计时将各SNP位点引物的退火温度控制在较小的范围，以利于后续的PCR扩增。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述退火温度范围的最高温度与最低温度的差值不大于10℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1.2)中所设计的引物长度为20-25bp。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1.2)中设计的所有引物在合成时等摩尔比例合并为一管，在后续多重PCR扩增时作为单引物扩增。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2.2)中采用MALBAC技术完成全基因组扩增。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中进行多重PCR扩增时，采用touchdownPCR扩增程序，覆盖多对引物退火温度，最终达到90％的覆盖度。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)在进行扩增时采用热启动DNA聚合酶或者高保真DNA聚合酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(4)中的测序类型为单端测序或者双端测序。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(5.5)的胚胎SNP-单体型分析中，区分型SNP最低为10个，若有3个以上SNP错误，此胚胎SNP-单体型数据视为数据量不足，难以进行分析。