[发明专利]一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物信息学领域，具体涉及一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法。

背景技术

2014年世界卫生组织统计，出生缺陷大约在33个婴儿中影响1人，每年造成约320万例与出生缺陷相关的残疾，每年估计有27万新生儿死于出生缺陷。出生缺陷可源自遗传、传染或环境方面的因素，许多出生缺陷是可以预防的，例如单基因遗传病，做好充分的孕前和产前筛查是关键。

胚胎植入前诊断(PGD)技术是指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎进行植入前活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的诊断方法，可从根源上阻断单基因遗传病的发生和传递，将出生缺陷的预防提前到胚胎阶段。然而，单基因遗传病的PGD检测并未广泛应用，其原因主要是由于标本量少(仅几个细胞)，容易产生等位基因脱扣(ADO)和污染，检测较为困难，现有技术无法完全满足PGD检测要求。

胚胎植入前单体型分析是目前PGD检测技术的主要方法。该方法通过检测突变位点和多个与其连锁的短串联重复序列(STR)或单核苷酸多态性(SNP)来确定突变连锁单体型，降低了等位基因扩增不平衡、ADO及污染的影响。其中，多重荧光PCR技术结合多个STR进行突变位点的单体型分析曾成为PGD检测连锁分析的主要技术方案，但是，STR连锁标记较少，应用到具体案例中可能会没有可用STR位点，所以进行临床检测前需要做大量预实验工作。而且，STR遗传标记大多距离致病位点较远，可能会由于染色体重组导致误诊。

相反，SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对(bp)中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多，且SNP不会发生STR中存在的多个核心序列重复、核心序列的非整倍重复等现象，此外，SNP检测对DNA样本的要求更低、价格更加廉价。因此，这种具备密度高、数量多、稳定性高并且高通量等特征的SNP标记，逐渐取代STR作为连锁分析标记的首选。

目前，检测遗传标记分型技术应用广泛的主要有多重荧光PCR(MF-PCR)、DNA芯片技术(SNP-array)、利用探针捕获SNP(国际公布号WO2015/042980)等，从一定程度上促进了SNP-单体型分析的发展。然而，上述各技术均存在一定的缺陷，例如多重荧光PCR技术采用多重PCR结合荧光探针检测STR分型，由于STR标记较少，距离较远易重组，实践中可用STR位点较少，检测成本较高，故此技术无法进行批量检测；而芯片和探针捕获SNP的方法，与普通PCR捕获SNP方法相比较，成本偏高，周期偏长。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是要克服现有技术中所存在的上述不足，提供一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法，其操作简单、结果准确，能够缩短检测周期、降低成本。

本发明的目的通过以下技术方案实现：本发明提供了一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法，具体步骤如下所述。

1.根据目标区域设计引物

1.1确定目标基因，根据具体种属，以NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)官方网站基因序列为参考序列确定目标基因所在染色体的具体位置，从而锁定捕获区域。

1.2多重PCR-SNP设计

1.2.1选择SNP区域，界定在目的基因上下游1M范围内，杂合度较高(千份个体数据库中频率大于0.3)；SNP间距越小，重组率越小。

1.2.2SNP区域捕获范围，在SNP位点上下游100bp，捕获片段大小为200bp左右。

1.2.3引物设计：利用Oligo、Primer等引物设计软件或引物专业设计网站进行引物设计，设计时尽量将各SNP位点引物的退火温度控制在较小范围内(如50-55℃、53-58℃、55-60℃或50-60℃等范围)，利于后面的PCR扩增，引物长度则控制在20-25bp左右。

1.2.4引物评估：引物设计完成后采用NCBI或UCSC等专业网站进行引物特异性评估(如错配率、发夹结构等等)，评估合格后进行引物合成，设计的所有引物在合成时等摩尔比例合并为一管，利用后面扩增单管操作。

2.家系样本及胚胎样本准备

2.1提取家系中患病个体、患病个体的父本以及母本的外周血样本，获得基因组DNA。

2.2采集胚胎细胞样本，利用MALBAC技术完成胚胎细胞的全基因组扩增；其中，胚胎细胞可以选自人或者其他哺乳动物。