[发明专利]用于分离和检测金属蛋白和小分子化合物的系统和方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学检测分析技术领域，具体涉及一种用于分离和检测金属蛋白和小分子化合物的系统和方法。

背景技术

蛋白质作为生物体的基本组成物质，也是生物体各种功能的执行者，对蛋白质组成、结构和功能的研究将直接阐明生命体在生理或病理条件下的变化机制。研究表明，人体内有三分之一的蛋白与金属元素结合形成金属蛋白(包括金属酶)。在这些金属蛋白中，金属离子(通常为过渡金属离子，比如铜、铁、锌或钼)作为活性中心或协同因子参与完成蛋白的催化、调节或者结构功能等作用。金属与蛋白质之间的相互作用在很大程度上决定了许多蛋白质的功能以及金属药物的药效。金属组学的一个重要目的是识别金属蛋白质(金属酶、金属输运蛋白质和金属应激蛋白质)，特别是蛋白质的金属结合位点，因此证实生物体系中存在金属蛋白并对不同种类的金属蛋白进行分离和检测具有十分重要的意义。

目前测定金属蛋白的技术主要有以液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)和凝胶电泳(GE)为基础的分离技术，以放射自显影技术、X射线荧光分析、中子活化分析等核心技术为基础的测定技术和以元素质谱(ICP-MS)与分子质谱(ESI/MALDI-MS)为基础的鉴定技术。关于金属蛋白的分离检测方法已有一些文献报道，但对于复杂蛋白样品的分离检测仍缺乏高效稳定的方法。Szpunar等报道了HPLC在金属蛋白方面的应用，此技术用于分离生物样品的金属蛋白时，对蛋白结合金属影响较小，其局限性主要表现在分离分辨率不够高，且色谱分离所用的流动相中的有机物和盐分对后续与之在线联用的ICP-MS元素检测有影响。近年来发展的毛细管区带电泳-电感耦合等离子体质谱(CZE-ICP-MS)，由于具有高选择性和灵敏度，成为分析生物分子的有力工具，但CZE进样量低且气流的稀释作用对后续元素分析的灵敏度有一定影响。对于金属蛋白的分离，CE需要极高的工作电压(10～40kV)，也可能造成蛋白结合金属的丢失，目前CZE-ICP-MS多用于方法研究，在实际样品中的应用仍有限。Tomlinson等分别利用SDS-PAGE和Native-PAGE两种凝胶电泳方法结合LA-ICP-MS技术对血清中Pt结合蛋白进行分析，发现通过Native电泳分离后的凝胶中可以检测到含Pt蛋白，而SDS-PAGE则造成蛋白结合Pt的丢失，但Native电泳对复杂蛋白样品分辨率较差。总之，目前还缺乏可用于复杂样品中金属蛋白的有效分离和灵敏检测的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种具有较高分离度和分辨率的用于分离和检测金属蛋白和小分子化合物的系统和方法。

为了实现上述目的，作为本发明的一个方面，本发明提供了一种用于分离和检测金属蛋白和小分子化合物的系统，包括阴离子交换柱、柱状电泳仪和电感耦合等离子体质谱仪，其中使用所述阴离子交换柱的离子交换色谱分离技术与使用所述柱状电泳仪的凝胶电泳采用离线联用，使用柱状电泳仪的凝胶电泳与电感耦合等离子体质谱仪采用在线联用；以及

检测样品经所述阴离子交换柱进行第一维的初步分离，初步分离产物再经所述柱状电泳仪和电感耦合等离子体质谱仪进行第二维的分离和检测。

作为本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于分离和检测金属蛋白和小分子化合物的方法，包括以下步骤：

采用离子交换色谱分离技术作为第一维分离方法，根据蛋白质等电点不同对检测样品进行初步分离，收集初步分离产物；

以凝胶电泳作为第二维分离方法，通过聚丙烯酰胺凝胶柱对上述初步分离产物进行再次分离；

通过电感耦合等离子体-质谱对上述再次分离产物中的金属离子和非金属离子进行定性与定量检测。

基于上述技术方案可知，本发明采用离子交换色谱-柱状凝胶电泳-电感耦合等离子体质谱联用技术，采用两维方法分离金属蛋白和小分子化合物，并用ICP-MS对其中的金属离子和非金属离子进行定性定量分析，实现了金属蛋白和小分子化合物的在线分离和检测。实验表明，IEC-GE-ICP-MS联用方法分离检测金属蛋白和小分子化合物具有操作简单、系统死体积小、分离效率高、检测灵敏度高、分析时间短、样品用量少、应用范围广等特点。本发明结合高效、快速分离的离子交换色谱、柱状凝胶电泳和高灵敏度、高选择性、多元素同时检测的ICP-MS建立了一种用于分离和检测金属蛋白和小分子化合物的方法。该方法不仅可用于金属蛋白的分离和检测，还可用于小分子化合物的分离及不同元素的检测，并且能推广应用于其他生物大分子的分离和检测。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。