[发明专利]一种α-L-鼠李糖苷酶在制备羟基脲糖苷衍生物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种α-L-鼠李糖苷酶在制备羟基脲糖苷衍生物中的应用，特别涉及一种利用α-L-鼠李糖苷酶原始酶合成羟基脲鼠李糖苷的方法，属于糖工程技术领域。

技术背景

羟基脲(Hydroxyurea)是一种核苷二磷酸还原酶抑制剂，作为细胞周期S期的特异性抗肿瘤药物，主要用于治疗慢性粒细胞白血病、黑色素瘤、头颈部癌、卵巢癌等。近年来，发现它对镰状细胞性贫血﹑β地中海贫血﹑银屑病、艾滋病等有一定疗效。羟基脲疗效确切，用途广泛，但由于其极性大和半衰期短等缺点，极大限制了临床疗效。对羟基脲进行分子改造，可提高其生物利用度，降低毒副作用。对抗肿瘤治疗药物进行鼠李糖基化修饰，可增加药物的肿瘤靶向性，增强疗效。

糖苷酶法对底物进行糖基化，步骤简单，成本低廉，条件温和，环境友好。但目前对羟基脲的分子改造以化学合成为主，如中国专利文献CN1061775A(申请号91111219.7)公开了一种采用化学方法合成羟肟酸和N－羟基脲衍生物的方法；尚无糖苷酶法对羟基脲修饰的报道。

目前，对羟基脲的糖基化修饰仅有葡萄糖通过化学方法修饰的N-(β-D-吡喃葡萄糖氧苷)脲一例，尚无鼠李糖基化修饰羟基脲的报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种α-L-鼠李糖苷酶在制备羟基脲鼠李糖苷衍生物中的应用。

一种羟基脲糖苷衍生物，名称为：羟基脲鼠李糖苷(1-Hydroxyureal-α-L-rhamnopyranoside)，化学结构式如下：

一种α-L-鼠李糖苷酶在制备羟基脲糖苷衍生物中的应用，所述的α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

一种酶法制备羟基脲鼠李糖苷的方法，包括如下步骤：

(1)用磷酸钠缓冲液配制鼠李糖浓度为0.3M～0.5M，羟基脲浓度为0.3M～0.5M，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的α-L-鼠李糖苷酶添加量为5μg～10μg/mL的反应体系；

(2)将步骤(1)制得反应体系于45～60℃水浴中反应24～48小时，煮沸终止反应，离心，取上清液；

(3)将步骤(2)制得的上清液，经分离、干燥后，制得羟基脲鼠李糖苷。

所述步骤(1)中氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的α-L-鼠李糖苷酶选用GenBank登录号为JN704640.1。上述α-L-鼠李糖苷酶对羟基脲具有显著转糖基活性。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的缓冲液为浓度10～100mM，pH6～8的磷酸钠缓冲液；根据本发明进一步优选的，所述步骤(1)中的缓冲液为50mM，pH6.5的磷酸钠缓冲液。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的离心为10000～12000转/分钟离心30分钟。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的反应条件为55℃水浴反应30小时。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的煮沸终止反应条件为100℃煮沸5分钟。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中的分离采用薄层层析进行分离。进一步优选的，所述的分离采用制备型薄层层析板分离。制备型薄层层析板可采用型号如Silicagel60F254(Merck,Germany)的薄层层析板。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中的干燥为冷冻干燥。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中还包括分离时的薄层层析检测，合并迁移距离相同的产物的步骤。

上述薄层层析检测的步骤如下：

薄层层析板点样后在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色；

上述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比10：3：2混合配制；显色剂是体积百分比为20％的硫酸和浓度为0.5wt％的3,5-二羟基甲苯的溶液。

上述羟基尿鼠李糖苷在制备防治肿瘤药物中的应用。

有益果

1、本发明首次发现氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的α-L-鼠李糖苷酶对羟基脲具有显著转糖基活性，并成功合成了羟基脲鼠李糖苷；

2、本发明以羟基脲为原料，以廉价鼠李糖底物为鼠李糖基供体，采用α-L-鼠李糖苷原始酶合成羟基脲鼠李糖苷，产物与其原料羟基脲相比，含有鼠李糖基，增加了肿瘤细胞靶向性，有助于提高原料药物的抗肿瘤活性，降低其毒副作用。

附图说明

图1为实施例1制得的羟基脲鼠李糖苷的质谱图；

图2为羟基脲鼠李糖苷的氢谱；