[发明专利]一种单细胞透射电镜制样方法

权利要求书

1.一种单细胞透射电镜制样方法，其特征是：包括以下步骤：

(1)、在体视显微镜下，将单细胞置于装有5-20微升体积浓度为2.5％的戊二醛的0.2mlEP管中，4℃固定30-60分钟；

(2)、准备一张干净的载玻片，用免疫组化笔在玻片中间画一个直径0.5-1.5cm的圆圈，干燥10-15秒，之后将上述包含有单个细胞的液体转移到圆圈正中间；在体视显微镜下检查单细胞是否在载玻片上；

(3)、置于室温或37℃烤箱，让液体刚好蒸发完，在体视显微镜镜下，及时加5-10微升甲苯胺蓝染液，染色1-3分钟后，用0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS)轻轻洗去染液；

(4)、将载玻片置于冰上，滴加30-60微升融化的质量百分浓度2％琼脂，冷却至50-60℃后再加，以免损伤细胞形态，进行预包埋；

(5)、待琼脂完全凝固后，将包含有单个细胞的琼脂块转移至常规透射电镜制样装置中；用0.1M磷酸盐缓冲溶液漂洗液漂洗3次，每次10-15分钟；

(6)、后固定：用质量百分浓度1％锇酸固定液固定40-60分钟，然后用0.1M磷酸盐缓冲溶液漂洗液漂洗3次，每次10-15分钟；

(7)、脱水：采用梯度丙酮系列脱水法脱水；

30％丙酮10-15分钟，

50％丙酮10-15分钟，

70％丙酮10-15分钟，

90％丙酮10-15分钟，

100％丙酮10-15分钟，两次；

(8)、树脂浸透：

用体积比为1：1的纯丙酮和Epon812包埋液的混合液浸泡单个细胞样品，置于37℃烤箱内6-12小时；再用Epon812包埋液纯包埋液置于37℃烤箱内浸透6-12小时；

(9)、包埋和固化：

将Epon812包埋液倒入包埋板孔中，迅速将浸透处理的单个细胞样品摆放在包埋板孔的一端，采用梯度升温聚合固化：37℃烤箱内12-24小时；60℃烤箱内12-24小时；

(10)、修块及超薄切片：超薄切片机切片，厚度：50-100nm；

(11)、染色：采用质量百分浓度1-3％醋酸铀染色液和柠檬酸铅染色液对超薄切片进行双染色。

2.根据权利要求1所述的单细胞透射电镜制样方法，其特征是：上述步骤(3)中所述的甲苯胺蓝染液即ToluidineBlue,质量百分浓度1％,PBS配制。

3.根据权利要求1或2所述的单细胞透射电镜制样方法，其特征是：上述步骤(11)所述的醋酸双氧铀染色液：3.85g醋酸双氧铀，用50ml50％或70％乙醇配制成饱和醋酸双氧铀染色液，充分溶解后过滤，pH3.4-4.0，4℃冰箱保存；

所述的柠檬酸铅染色液：

配方：

硝酸铅1.33g；

柠檬酸纳1.76gddH2O，用前煮沸并冷却，30ml；

配置方法：(1)分别称取硝酸铅和柠檬酸纳，并依次加入50ml容量瓶中，再加入30ml的ddH2O，震荡30分钟，直到成为乳白色混悬液；(2)向混悬液中加入8ml1mol/l的NaOH溶液；(3)过滤到一个棕色瓶中，密封，4℃冰箱保存。

4.根据权利要求3所述的单细胞透射电镜制样方法，其特征是：所述的柠檬酸铅染色液的配置方法的步骤(3)过滤到一个棕色瓶中，密封，4℃冰箱保存，在液面上加少量液体石蜡油。