[发明专利]一种单细胞透射电镜制样方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种透射电镜(TransmissionElectronMicroscopy,即TEM)超薄切片样品的制备方法，尤其是涉及一种单细胞透射电镜制样方法。

背景技术

随着精准医学的发展，观察和了解单一个细胞生理和病理状态下各种细胞器的超微形态结构，对基础医学研究和临床病理诊断具有重要意义。目前对动物细胞的结构观察中，光学显微镜和电子显微镜是必不可少的工具，光镜观察显示的结构图像，受限于其放大倍数，结构信息十分有限；透射电镜可观察细胞超微结构(隋淑光.用电镜半薄切片技术制备光镜连续观察样品的实验[J].生物学教学,2011,36(7):58.)。故而，透射电子显微镜是研究生物超微结构的重要工具(AFiltrationBasedTechniqueforSimultaneousSEMandTEMSamplePreparationfortheRapidDetectionofPathogens[J].Viruses-Basel,2014,6(9):3458-3471)。对于生物样品而言，TEM样品的制备对于TEM观察至关重要，常规超薄切片技术的制样过程一般包括为固定、清洗、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤(UseofpermanentmarkertodepositaprotectionlayeragainstFIBdamageinTEMspecimenpreparation[J].JMicrosc,2014,255(3):180-187)。

常规超薄切片技术的制样对的生物样品有一定的体积要求，一般是肉眼可见，否则在繁琐的制样过程中难以操作。单一个细胞体积小且颜色不显眼。而在科研和医疗实践中会遇到受限于客观实际，只能获得一个细胞，比如人卵细胞；或科研实际需要，只了解某一个细胞的超微结构变化。而常规的常规超薄切片技术的制样无法满足单细胞制样的要求；针对单细胞透射电镜制样，目前尚无较好的解决方案。因此如何制备高质量的单个细胞透射电镜超薄切片是困扰生物医学电镜从业者的一个难题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能满足单个细胞透射电镜样品制备要求，进而能对单个细胞的超微结构进行研究和病理诊断分析的单细胞透射电镜制样方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供的单细胞透射电镜制样方法，包括以下步骤：

(1)、在体视显微镜下，将单细胞置于装有5-20微升体积浓度为2.5％的戊二醛的0.2mlEP管中，4℃固定30-60分钟；

(2)、准备一张干净的载玻片，用免疫组化笔在玻片中间画一个直径0.5-1.5cm的圆圈，干燥10-15秒，之后将上述包含有单个细胞的液体转移到圆圈正中间；在体视显微镜下检查单细胞是否在载玻片上；

(3)、置于室温或37℃烤箱中，让液体刚好蒸发完，在体视显微镜镜下，及时加5-10微升甲苯胺蓝染液(ToluidineBlue,质量百分浓度1％,PBS配制)，染色1-3分钟后，用0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS)轻轻洗去染液；

(4)、将载玻片置于冰上，滴加30-60微升融化的质量百分浓度2％琼脂，冷却至50-60℃后再加，以免损伤细胞形态，进行预包埋；

(5)、待琼脂完全凝固后，将包含有单个细胞的琼脂块转移至常规透射电镜制样装置中；用0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗液漂洗3次，每次10-15分钟；

(6)、后固定：用质量百分浓度1％锇酸固定液固定40-60分钟，然后用0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗液漂洗3次，每次10-15分钟；

(7)、脱水：采用梯度丙酮系列脱水法脱水；

30％丙酮10-15分钟，

50％丙酮10-15分钟，

70％丙酮10-15分钟，

90％丙酮10-15分钟，

100％丙酮10-15分钟，两次；

(8)、树脂浸透：

用体积比为1：1的纯丙酮和Epon812包埋液的混合液浸泡单个细胞样品，置于37℃烤箱内6-12小时；再用Epon812包埋液纯包埋液置于37℃烤箱内浸透6-12小时；

(9)、包埋和固化：

将Epon812包埋液倒入包埋板孔中，迅速将浸透处理的单个细胞样品摆放在包埋板孔的一端，采用梯度升温聚合固化：37℃烤箱内12-24小时；60℃烤箱内12-24小时；

(10)、修块及超薄切片：超薄切片机切片，厚度：50-100nm；

(11)、染色：采用质量百分浓度1-3％醋酸铀染色液和柠檬酸铅染色液对超薄切片进行双染色；