[发明专利]用于茶氨酸生产的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法

权利要求书

1.一种茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)、将基因工程菌进行接种于含有所述工程菌所转入的质粒具有抗性对应的抗生素的LB固体选择培养基上进行筛选培养，筛选出抗性菌株；

所述基因工程菌由γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒转化至大肠杆菌表达菌株中所得到；所述表达质粒上的γ-谷氨酰甲胺合成酶的碱基序列为SEQ ID NO:1所示；所述大肠杆菌表达菌株为Transetta；

所述筛选培养的培养条件为：36～38℃恒温倒置培养12～16h；

2)、将所述抗性菌株进行诱导培养，以诱导gmas基因表达；在所述培养过程中，用SDS-PAGE方法检测γ-谷氨酰甲胺合成酶的表达情况，检测合格后通过低温离心发酵培养基获得湿菌体；

3)、利用所述湿菌体在生物转化反应体系中进行催化底物生成L-茶氨酸；在所述的生物转化反应体系中：

催化底物反应液中包括：130～180mM谷氨酸钠、130～180mM乙胺盐酸盐、10～20mM六水氯化镁、3～8mM氯化锰、3～8mM ATP；

培养温度为28～32℃，摇菌转速为100～300rpm，培养时间为35～45h。

2.如权利要求1所述的茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述诱导培养的具体培养过程为：

将步骤1)中筛选出的抗性菌株接种于含与所述质粒具有抗性对应的抗生素的LB液体培养基中，36～38℃，200～240rpm培养6～8h；随后将菌种接种于含与所述质粒具有抗性对应的抗生素的TB培养基中，当菌浓度培养至OD600为0.8～1.2时添加诱导剂，降温至22～30℃诱导15～20h。

3.一种如权利要求1所述方法中的所述γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、针对大肠杆菌表达系统对Methylovorus mays NO.9来源的GenBank Accession号为AB333782.1的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因原始序列进行优化，将原始序列中的低频密码子转换为同义的大肠杆菌高频密码子，将原序列中的终止子替换成TAAT强终止子，在原序列两端添加上了限制性内切酶的酶切位点，得到优化的gmas基因序列；

2)、以优化的gmas基因序列为模板，合成碱基序列为SEQ ID NO:1所示的gmas基因片段；

3)、将所述优化的gmas基因片段连接到原核表达载体上，得到γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒。

4.如权利要求3所述的γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤3)的具体步骤为：

将所述的gmas基因片段连接到克隆载体上，得到克隆载体-gmas；

对克隆载体-gmas进行扩增；

将gmas基因片段从克隆载体-gmas上酶切下来，连接到经过相同限制性内切酶切割的表达载体上，构建获得的重组载体即为γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒。

5.如权利要求4所述的γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，其特征在于：

所述克隆载体为pUC57；

所述表达载体为pET-32a。