[发明专利]用于茶氨酸生产的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种用于茶氨酸生产的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法，本发明提供一种γ‑谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒，所述质粒中的目的基因序列经过了优化，在大肠杆菌中表达效率高，其中的γ‑谷氨酰甲胺合成酶基因表达出的γ‑谷氨酰甲胺合成酶本身活性就很高，可解决现有的用于茶氨酸的酶活性低下的问题；而且其催化的底物为低成本的谷氨酸和乙胺，可解决现有技术底物成本较高的问题。本发明还提供了一种茶氨酸基因工程菌及其配套的培养方法，该基因工程菌由γ‑谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒转化得到，可用于生产茶氨酸，易于培养，可解决现有菌株不够稳定的缺点。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种用于茶氨酸生产的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法。

背景技术

茶氨酸(L-Theanine)是茶叶中特有的游离氨基酸，属于酰胺类化合物，学名为N-乙基-γ-L-谷氨酰胺(5-N-ethyl-γ-L-glutamine)。茶氨酸在化学构造上与脑内活性物质谷酰胺、谷氨酸相似，是茶叶中生津润甜的主要成份。

茶氨酸主要应用于医药和食品领域。在医药方面，茶氨酸具有降血压的作用；与抗癌药物共同使用，可以增强抗肿瘤药物的疗效；具有松弛神经紧张和焦虑的作用；能引起脑内神经递质的变化，促进大脑的学习和记忆功能，并且能对帕金森症、传导神经功能紊乱等疾病起到预防效果；具有改善经期综合征和减肥的作用；另外，茶氨酸有抗疲劳、提高免疫力和防御病毒的作用。在食品方面，茶氨酸作为茶饮料的品质改良剂、改善食品风味的添加剂和功能食品的添加剂。另外，茶氨酸还应用于化妆品中作为保湿剂和皮肤保湿食品等。

目前，茶氨酸的合成方法主要有化学合成法和生物转化合成法。化学合成法反应过程复杂，副产物多，提取困难，收率较低，安全性差，能耗高且污染大，不适合工业化生产。生物转化合成法又可以分为茶树愈伤组织培养法、酶转化法合成和微生物转化法。其中，茶树愈伤组织培养法茶氨酸生产量低，产品分离纯化过程复杂及生产工艺的控制难度大，这种植物组织细胞培养法本身也还只在试验研究阶段。酶转化法合成是从微生物中提取酶，用酶提取液作为催化剂，催化底物一步转化生成茶氨酸，此法可以实现酶与底物充分接触，转化周期短，但酶极其不稳定，无法制成纯品再加入到合成反应器中，且无法回收利用。

微生物转化法是用完整的微生物细胞将底物一步转化为茶氨酸，此法的实质和酶转化法合成一样是利用微生物体内的裂和酶或转胺酶来进行转化底物，微生物发酵法生产的茶氨酸具有成本低、容易从反应液中提取获得产物、转化效率高、可大量生产的特点，因此，采用微生物发酵是实现茶氨酸规模化生产的必由之路。

近年来，有学者筛选高活性产茶氨酸的微生物菌株进行生产茶氨酸，但由于酶活较低，茶氨酸的产量很低。此外，很多用于构建基因工程菌的质粒还存在表达效率低、不够稳定的缺点。同时，也有学者利用基因工程技术构建表达关键酶的重组菌通过微生物转化法生产茶氨酸，但大多数克隆的是γ-谷氨酰基转肽酶，催化的底物是谷氨酰胺和乙胺，底物成本较高，不利于工业化生产。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒，所述的质粒在大肠杆菌中表达效率高，其中的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因表达出的γ-谷氨酰甲胺合成酶本身活性就很高，可解决现有的用于茶氨酸的酶活性低下的问题；而且其催化的底物为低成本的谷氨酸和乙胺，可解决现有技术底物成本较高的问题。

本发明的第二目的在于提供一种γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，该构建方法可对γ-谷氨酰甲胺合成酶的原始序列进行优化，可解决现有技术所用质粒表达效率低的问题。

本发明的第三目的在于提供茶氨酸基因工程菌，该基因工程菌由γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒转化得到，可用于生产茶氨酸，且该基因工程菌易于培养，可解决现有菌株不够稳定的缺点。