[发明专利]一种交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物大分子分离介质的制备方法，尤其涉及一种交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法。

背景技术

近年来,生物技术的发展非常迅速。运用基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术，已能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。和其它生物产品的生产过程一样，蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。上、中游过程是运用生物技术生产目标产物，下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物，涉及到二十多个单元操作，占整个生产成本的70-80％，其中，层析是一门关键技术。由于层析技术具有分离效率高、过程易于放大、易于自动化的特点，其应用也最为广泛。

根据不同的保留机制，层析介质分为：凝胶过滤介质、离子交换介质、疏水作用层析介质、亲和层析介质等。良好的蛋白分离层析介质一般需满足以下几个条件：(1)高度的亲水性。以便蛋白能够与之发生可逆性的吸附；(2)适宜孔径结构。便于大分子量的活性蛋白扩散进出,通过表面作用或体积排阻实现蛋白质的分离；(3)适宜功能基团密度。使其具有较高的吸附容量。

现在广泛应用的蛋白质层析分离介质的骨架一般琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等亲水材料的凝胶微球。对于离子交换型层析介质，交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球是应用最为广泛的分离材料之一。出于商业上的考虑，国内外文献中有关其羧甲基化琼脂糖凝胶微球的制备技术的报道并不多，且语焉不详。其一般制备步骤是：(1)首先制备琼脂糖微球；(2)将微球交联，以提高其机械强度和获得适宜的孔径结构；(3)在交联微球上键联羧甲基功能基团。但是上述制备方法中，由于羧甲基化反应须在强碱性条件下完成，使得交联微球的机械强度和孔径结构易于发生变化，进而影响羧甲基化琼脂糖基凝胶微球分离性能和机械强度。因此，在利用该方法制备交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球时，存在生产过程中羧甲基化反应对微球机械强度和孔径影响不易控制的缺点，且产品分离性能的稳定性差。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法。

本发明所述交联羧甲基化琼脂糖基凝胶微球的制备方法，步骤是：

(1)将琼脂糖和95％的乙醇按1g:3～8ml的比例加入反应器中，然后按琼脂糖和NaOH为1g:1.4～2g的比例加入NaOH，室温下搅拌12±1h，再按氯乙酸和NaOH为1g：1.4～2.0g的比例滴加氯乙酸溶液，并使氯乙酸与总反应液的体积为1g:3～12ml的比例，在温度20～45℃下反应2～4h；然后升温至60～65℃反应8±1h，完毕后，用滤纸过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤并在80±2℃下干燥24h以上，得到羧甲基化琼脂糖；其中，所述氯乙酸溶液是按氯乙酸与95％乙醇为1g:1～4ml的比例配制；

(2)按设定量称取羧甲基化琼脂糖，加入水中并加热溶解，配成浓度以g/ml计为3～6％的羧甲基化琼脂糖溶液，在90±2℃温度条件下保温备用；

(3)将含有Span 80的大豆油作为油相加入反应器，其中所述Span 80在大豆油的含量以体积百分比计为4～9％，在90±2℃下以800r·min^-1转速搅拌0.5～1h后将步骤(2)制得的羧甲基化琼脂糖溶液与油相按体积比为1:4～1:10的比例加入油相中，继续在800r·min^-1转速下搅拌45±5min，然后用冰水浴将反应液冷却至10～30℃，再在200r·min^-1转速下搅拌20±3min，完毕后，用250目的滤布过滤，收集的沉淀物用95％乙醇洗涤去残余的油相，沉淀为羧甲基化琼脂糖基凝胶微球；按凝胶微球与50％乙醇按体积比为1:10的比例将所述微球置于50％乙醇中贮存，备用；