[发明专利]一种滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法

说明书

本发明公开了一种滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法，该方法根据滇一型粳稻不育系细胞质中线粒体基因组中不育基因和细胞核中的恢复基因序列，分别设计了两对引物(csSPF与csSPR1)和(RFSPF2与RFSPR21)，利用这两对引物，进行PCR扩增，根据两对引物的扩增结果，可准确的判定滇一型粳稻不育系，并将之与保持系、恢复系及杂交种区分开，达到高效、快速、准确鉴定不育系的效果。相比于传统技术，本发明设计独到，方法简单，准确率高，能够充分满足目前的发展要求，使得育性基因分子定位更加精确，推动了基因分子鉴定领域的发展。

技术领域

本发明专利属于农业生物技术领域中的育种领域，特别涉及一种滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法。

技术背景

水稻是我国重要的粮食作物之一，杂交水稻的育成为我国粮食生产和温饱问题的解决做出了巨大贡献，有效利用水稻杂种优势的基础是雄性不育系的选育应用。其中一类是核基因与细胞质基因互作控制的细胞质雄性不育，另一类是由遗传和环境互作控制的核雄性不育，包括光敏感及温敏感雄性不育。目前粳稻上主要是利用核质基因互作的细胞质雄性不育系，雄性不育系的细胞质类型有包台型(BT型)和滇一型两种。近20年来，分子标记技术的迅猛发展，加快了水稻育性恢复基因的定位和作图的研究步伐。不同学者采用不同的分子标记技术对不同质源的育性恢复基因进行了定位研究，其中以野败型、BT型、滇一型研究较多。

育性恢复基因分子定位的日趋精确，为恢复基因的分子鉴别提供了可能。但分子标记辅助选择时，首先应考虑前景选择的可靠性。而前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间的连锁程度，只有连锁非常紧密，才能够达到较高的准确率。选择的准确率随重组率的增加迅速下降，在分子辅助选择育种中，若要求选择的准确率达到90％以上，则标记与目标基因的重组率必须小于5％,当重组率达到10％时，选择的准确率已降到80％。

另一方面，由于对不育基因的研究相对滞后，就目前的分子鉴别发展技术来看，还缺乏一种能够快速、有效、准确地检测滇一型粳稻不育系的方法和手段。

发明内容

本发明根据滇一型粳稻不育系细胞质中线粒体基因组中不育基因和细胞核中的恢复基因序列，分别设计了两对引物来进行PCR扩增，根据两对引物的扩增结果，可准确的判定滇一型粳稻不育系，并将之与保持系、恢复系及杂交种区分开，达到高效、快速、准确鉴定不育系的效果。

本发明的技术方案是：提出一种滇一型三系杂交粳稻不育系的分子鉴定方法，该方法包括以下步骤：

(1)将待鉴别的水稻材料叶片提取总DNA；

(2)分别设计了两对引物(csSPF与csSPR1)和(RFSPF2与RFSPR21)，利用这两对引物，分别进行PCR反应；

(3)根据两对引物的扩增结果，判定滇一型粳稻不育系，并将之与保持系、恢复系及杂交种区分开。

以上所述的引物csSPF与csSPR1序列分别为AACCAACGCCGACCCCAAACA和GGCCGCCCTCCCACCTT。

以上所述的引物RFSPF2与RFSPR21序列分别为CCTAATTCATGGTTTGTGCACCTGTA和GCCAAGCAATATCCATTGATAAGAGTATTG。

以上所述的两个PCR反应液的总体积均为15ul，含2×Taq PCR Master Mix(博迈德生物)7.5μL，2个引物(10μmol/L)各0.3μL，模板DNA(15ng/μl)1μl，ddH₂O 5.9μl。

以上所述的引物csSPF/csSPR1扩增程序为：

(1)反应液在94℃下预变性5min；

(2)之后反应液分别在94℃变性45s、68.5℃复性45s、72℃延伸30s，并将上述步骤重复28个循环；