[发明专利]临床治疗级细胞治疗用黑色素细胞(melanocytes)规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法

权利要求书

1.一种用于筛选和培养临床治疗级细胞治疗用黑色素细胞(melanocytes)规模化制备的培养基组合，其特征在于，其包括；

培养液A：灭活胎牛血清40～60ml、转铁蛋白5～15μg/ml、维生素B40.5～1×10^-4/L、维生素C1～3μg/ml、胰岛素2～4μg/ml、青霉素50-100u/ml、霍乱霉素2.5～4.5u/L、EGF5～25ng/m1、十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)0.1～0.3μg/ml、G41880～100μg/ml、链霉素50～100μg/ml氢化可的松0.4μg/ml、商用培养基DMEM/F12(3∶1)定容到500ml；

培养液B：灭活胎牛血清80ml、转铁蛋白6～17μg/ml、维生素B40.5～1×10^-4/L、维生素D21～3μg/m1、维生素C1～3μg/ml、胰岛素2～3μg/ml、节丝霉素B0.2～0.6μg/ml、霍乱霉素2.5～4.5u/L、EGF5～25ng/ml、牛脑垂体提取物(BPE)1～3mg/L、氢化可的松0.3μg/ml、链霉素50～100μg/ml、十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)0.1～0.3μg/ml、内皮素-115～30μg/ml、bFGF5～15ng/ml、G41880～100μg/ml、腺苷10～25mg/ml、商用培养基DMEM与商用培养基F12(1∶1)定容到500ml；

配制培养液C：灭活胎牛血清60ml、转铁蛋白6～17μg/ml、维生素B40.5～1×10^-4/L、维生素D21～3μg/m1、维生素C1～3μg/ml、胰岛素2～3μg/ml、节丝霉素B0.2～0.5μg/ml、霍乱霉素2.5～4.5u/L、EGF5～25ng/ml、牛脑垂体提取物(BPE)1.5～3mg/L、链霉素50～80μg/ml、氢化可的松0.3μg/ml、十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)0.1～0.3μg/ml、内皮素-115～30μg/ml、bFGF5～15ng/ml、G41860～80μg/ml、腺苷10～25mg/ml、商用培养基DMEM与商用培养基F12(1∶1)定容到500ml；

2.一种制备高拟体内细胞外基质的方法，其特征在于，其包括步骤：

a)取材及皮肤消毒处理；b)脱细胞处理；优选地，还进一步包括将消毒或经脱细胞处理的皮肤进一步进行低温、脱水、辐照灭菌处理；

所述步骤b)的脱细胞方法选自冷酶交联剂法、酶-非离子表面活性剂-络合剂联合法、络合剂加盐-阴离子表面活性剂法或胰酶联合EDTA交联液法。

3.权利要求2所述方法，其特征在于，其中冷酶交联剂法是：加入0.1～0.25％蛋白酶冰浴冷消12～48h。用含0.25％戊二醛磷酸缓冲溶液，PH在7.20～7.40之间，交联4～6h，超纯水或注射用水冲洗8～10次。

4.权利要求2所述方法，其特征在于，其中酶-非离子表面活性剂-络合剂联合法是：0.1～0.25％中性蛋白酶与0.01～0.02％EDTA，TritonX-100(0.3～0.6％)溶液，室温下作用24～48h。

5.权利要求2所述方法，其特征在于，其中络合剂加盐-阴离子表面活性剂法是：0.01～0.02％EDTA含0.6～0.8mol/L氯化钠溶液，37℃下作用12～24h，后用(0.2～0.5％SDS溶液，室温下作用30～60min)。

6.权利要求2所述方法，其特征在于，其中胰酶联合EDTA交联液是：0.25～0.40％胰蛋白酶和0.02～0.04％EDTA(1∶2)，37℃快速消化10～60min。交联液中交联4～6h。交联后用超纯水或注射用水冲洗8～10次。

7.由权利要求2-6所述任一方法制备的高拟体内细胞外基质。

8.权利要求2-6所述任一方法制备的高拟体内细胞外基质或者权利要求7所述的高拟体内细胞外基质在筛选临床治疗级细胞治疗用黑色素细胞中的用途。