[发明专利]临床治疗级细胞治疗用黑色素细胞(melanocytes)规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法

说明书

一、技术领域：

本发明属于生物黑色素细胞技术，组织工程领域。涉及一种体外构建高模拟体内贴附环境分离筛选，皮肤干细胞的培养、扩增技术。获得临床治疗级皮肤黑色素细胞应用于组织工程皮肤构建技术中的活性种子细胞。

二、背景技术介绍：

细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)广泛存在于细胞间隙的基本填充成分，是细胞新陈代谢、生长、繁殖、分化、表达、传递、互惠所依赖的及其重要场所。早期研究学者认为.外基质只是一种组织内、细胞外的单纯的支持结构。Hauschka和Konigsberg在1966年研究发现填充组织间隙的胶原与促进成肌细胞转化肌管的现象。并在两年之后，得以证明学者们才对这种稳定外物质微环境有了新的认识和思考。

Hay在11年后报道了ECM对胚胎发育过程具有重要的诱导作用。ECM影响细胞行为的现象得以关注并进行广泛的研究但是并没有成型的理论基础佐证ECM与细胞的密切关系。直到1982年有学者提出证明并建立ECM与细胞骨架和核基质之间“动态互惠”的模型。在这个模中，ECM分子与细胞表面受体互相作用，然后把信号通过细胞膜传导进入细胞浆中，引起从细胞骨架到细胞核的一系列变化，引起某些特定基因的表达。

并证明这些基因的表达产物又可以反过来对ECM发生作用，今天的许多研究证实了这个模型的合理性，并且证明细胞和ECM相互作用直接参与了细胞的黏附、生长、游走、分化和程序性死(凋亡)的过程；外基质参与调节细胞因子、生长因子的活性；还能够直接激活、启动细胞内信号传导机制。由于这种对细胞的调节和对信号的传导作用。因此，我们必须充分了解细胞外基质的化学的、物理的、生物学性质和功能及其在组织的形成和修复中的作用，才能更好地应用这些生物材料构建成为组织接受，乃至模拟组织完善再生的“生物构架”。我们建立的高拟细胞外基质材料利用的恰是反向理论，指导我们深入开展对ECM的认识，同时也反作用得到我们可利用的干细胞，这种研究模式促进学科前行及发展。

黑色素细胞在正常皮肤组织中含量极少，黑色素细胞公认是一种在体外具有无限更新能力，体外培养具有长期生长潜能并可形成无限克隆。是色素脱失性疾病的重要参与者，是开展病因，病理生理学研究重要细胞手段。但由于目前缺乏理想筛选方法，对临床治疗级黑色素细胞进行筛选及鉴定方法报道较少。

三、皮肤细胞名称概述

黑色素细胞(melanocyte，MC)来源于神经嵴的树突细胞。黑色素细胞培养是在皮肤表皮细胞培养基础上发展起来的。黑色素细胞培养研究和治疗色素异常性皮肤病(白癜风)及黑色素肿瘤有重要意义，为研究发病机制提供重要的条件与科研途径。

成人表皮层中黑色素细胞极少，基底层1560/mm².只占表皮细胞的2％。

体外环境下培养生长缓慢。增值能力极为有限，容易被角质形成细胞以及成纤维细胞污染，培养条件筛选复杂。其基本原理和方法是：用胰酶消化法使表皮和真皮分离，用机械法从表皮的内面获得黑色素细胞，利用差速粘附行为以及在添加适当成分的培养基中培养剔除污染相关细胞达到纯化培养过程。

四、传统筛分方法介绍

因为皮肤细胞对基底膜有较强的粘附性，对细胞胞外基质的粘附速度要比其它类型细胞快得多，所以利用该种特性进行培养筛选。目前传统的皮肤细胞筛选如下阐述：

方法一(3T3滋养层法)：人类皮肤细胞体外培养研究己有1个世纪的历史背景，建立体外扩增培养体系于1975年由学者Rheinwald和Green所设计3TS-J2小鼠胚胎瘤的成纤维细胞株3T3滋养层细胞，并用γ射线致死剂量照射，防止细胞受到异种物种的影响。灭活3T3滋养层细胞作为培养细胞的滋养层能促。进形黑色素细胞筛选的贴附和生长，并具有未被论证的接触性抑制成纤维细胞生长的功能。实验室所选用的、功能较稳定的个亚系但还不能完全排除对它的顾虑，还需继续观察和探索有效的替代方法。

方法二(纤维蛋白原及凝血酶底物法)：GraziellaP学者研究用纤维蛋白原及凝血酶作为基质分离黑色素细胞；

方法三(IV型胶原黏附法)：JonePH等利用上述方法从成人包皮或尸体皮经消化，利用IV型胶原做底物基质分离黑色素细胞，所选用底物为异种胶原，存在不同种属的污染可能性，并且底物昂贵，不适合产业化规模或长期培养，适合试验性小剂量研究；