[发明专利]抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法

权利要求书

1.抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、抗菌肽基因的合成及克隆载体的构建

S11、设计如下两对四条引物，每对都具有互补序列

F1：5′-GCTCTAGAGGTTGGCTGAAAAAAATCGGCAAGAAGATTGA-3′

R1：5′-ACGGGTATGTTGGCCAACACGTTCAATCTTCTTGCCGATTTTTTTC-3′

F2：5′-GGCCAACATACCCGTGATGCCATCCTGCCGATTCTGAGCCTGATTGGTGGTCTG-3′

R2：5′-TCCCCCGGGTTATTTACCCAGCAGACCACCAATCAGGCTCAGAATC-3′

S12、将引物F1与R1、F2与R2分别进行延伸，得到延伸液P1、P2。具体步骤如下：提前开起PCR仪预热，将2×TaqMasterMix25μL、上游引物F1(10μM)2μL、下游引物R1(10μM)2μL、RNase-Freewater21μL加入到PGR反应管中，混合均匀，瞬时离心后，置于PCR仪中，反应条件为：94℃预变性2min；30个循环；72℃终延伸2min，得延伸液P1。重复以上工艺，得延伸液P2；

S13、以第一次PCR得到的延伸液P1与P2相互作为彼此的模板和引物进行PCR，具体步骤如下：提前开起PCR仪预热，将2×TaqMasterMix25μL、P10.5μL、P20.5μL、RNase-Freewater24μL加入到PCR反应管中，混合均匀，瞬时离心后，置于PCR仪中，反应条件为：94℃预变性2min；30个循环；72℃终延伸5min，得抗菌肽基因；

S14、将所得的抗菌肽基因与克隆载体pMD18-T载体连接，在0.2mL微量离心管中，加入pMD18-TVector1μL，胶回收后的抗菌肽基因2μL，ddH₂O2μL，Solution1(冰上融化)5μL，全量为10μL；混合均匀，瞬时离心后，置于连接仪中，4℃，12h，得pMD18-T/CC34；

S15、将含有表达载体pHT43的大肠杆菌接种到3mL含有10μg/mLCm的LB培养基中，37℃200rpm振荡过夜培养，提取质粒，将其与-20℃保存的鉴别正确的克隆质粒分别进行双酶切，酶切体系如下：Xbal1μL、Saml1μL、质粒DNA10μL、CutSmartBuffer2μL、灭菌的双蒸水6μL；酶切反应条件为：37℃水浴，3h，其中质粒DNA分别为：pHT43、pMD-18T/CC34质粒；

S16、取上述试剂于PCR反应管中，混匀后瞬时离心，使溶液聚集在试管底部，37℃水浴3h后，酶切反应完全；

S17、将酶切好的CC34基因片段和酶切后的质粒pHT43进行连接，即可构建成质粒载体pHT43/CC34，连接反应体系如下：CC34基因6μL、10×T4DNAligaseBuffer1μL、质粒pHT432.5μL、T4DNAIigase0.5μL；连接反应条件为：16℃水浴，过夜；

S2、重组表达载体pHT43/CC34转化到宿主细胞中，构建三种表达工程菌菌株；

S3、将步骤S2得到的表达工程菌以IPTG为诱导剂表达，获得表达产物；

S4、分离纯化步骤S3所得的表达产物，获得抗菌肽蛋白CC34，并检测其正确性。

2.根据权利要求1所述的抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所述步骤S2中的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB800N。

3.根据权利要求1所述的抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所述步骤S3中所述表达产物为离心上清液。

4.根据权利要求1所述的抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所述步骤S4中所述分离纯化采用高效液相色谱法(HPLC)纯化，利用质谱法(MS)检测其正确性。

5.根据权利要求1所述的抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所述步骤S4中所述分离纯化鉴定正确的抗菌肽CC34，在制备治疗革兰氏阴和/或革兰氏阳性菌疾病药物、动物饲料添加剂中的应用。

6.根据权利要求1所述的抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，其特征在于，所述步骤S12和步骤S13中的30个循环为94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s。