[发明专利]抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物领域，具体涉及抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法。

背景技术

抗菌肽是动、植物和人类先天性免疫机制的组成部分，在机体受到病毒、细菌等攻击时被诱导产生。抗菌肽具有广谱抗菌作用，尤其是对一些产生抗生素耐药性的病原菌的杀灭作用更引起了人们对它的兴趣。抗菌肽在农业、医疗、食品等领域的应用潜力巨大。迄今为止，已经发现了上千种天然抗菌肽，但是具有较好的医疗选择指数的种类却比较少，因此，人们希望通过分子上的重新设计，例如，杂合肽的设计等方式从丰富的天然抗菌肽资源中获得理想的新型人工抗菌肽。

杂合抗菌肽的设计特点是集两个(或以上)天然肽的优点于一身，经过适当的人工修饰后，可以扬长避短，最大程度上发挥抗菌活性，并不引起溶血。天蚕素抗菌肽(cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌肽；家蝇天蚕素抗菌肽(CecMd)是本实验室经诱导家蝇幼虫，然后克隆得到的(同源性81％)。而Chensirin是近年来发现的中国东北林蛙皮肤上分泌的天然抗菌肽，其活性很高，但具有较高的溶血活性。通过对两者进行杂合设计，获得了低溶血，高抗菌活性的新型杂合抗菌肽CC34，与天然肽相比具有很大的优势。本研究团队已将抗菌肽CC34在大肠杆菌、毕赤酵母表达体系成功表达，尚未开展在其他菌种表达体系方面的研究，为此，我们将抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌表达体系进行表达研究。

枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)作为外源基因的表达宿主，具有如下优点：(1)B.Subtilis是好氧菌不含热源脂多糖(Iipopolysaccharides，LPSs)，有益菌无致病性；B.Subtilis被美国FDA认可为安全性菌株。(2)B.Subtilis细胞膜为单层，而大肠杆菌的为双层，分泌的蛋白在B.Subtilis体系下比在大肠杆菌体系下更容易回收、纯化，操作简便，许多酶都是B.Subtilis产生的分泌到胞外的蛋白。(3)长期的研究表明，B.Subtilis没有明显的密码子偏爱性。(4)B.Subtilis对培养基的要求比较简单，在生产中绝对占有经济优势，噬菌体、质粒都可作为克隆载体，B.Subtilis有良好的转录翻译系统，可以避免形成错误折叠的蛋白质、包涵体。(5)B.Subtilis的单基因、芽孢的形成等都受多基因调控；16SrRNA3’端的序列也有别于大肠杆菌。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种分离纯化简单、蛋白纯度高、适于大规模工业化生产的抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

抗菌肽CC34在枯草芽孢杆菌中的表达方法，包括如下步骤：

S1、抗菌肽基因的合成及克隆载体的构建

S11、设计如下两对四条引物，每对都具有互补序列

F1：5′-GCTCTAGAGGTTGGCTGAAAAAAATCGGCAAGAAGATTGA-3′

R1：5′-ACGGGTATGTTGGCCAACACGTTCAATCTTCTTGCCGATTTTTTTC-3′

F2：5′-GGCCAACATACCCGTGATGCCATCCTGCCGATTCTGAGCCTGATTGGTGGTCTG-3′

R2：5′-TCCCCCGGGTTATTTACCCAGCAGACCACCAATCAGGCTCAGAATC-3′

S12、将引物F1与R1、F2与R2在如下的PCR反应体系中分别进行延伸，得到延伸液P1、P2。具体步骤如下(以P1的PCR反应体系为例)：提前开起PCR仪预热，将2×TaqMasterMix25μL、上游引物F1(10μM)2μL、下游引物R1(10μM)2μL、RNase-Freewater21μL加入到PCR反应管中，混合均匀，瞬时离心后，置于PCR仪中。反应条件为：94℃预变性2min；30个循环；72℃终延伸2min，得延伸液P1。同理，可获得延伸液P2；

S13、以第一次PCR得到的延伸液P1与P2相互作为彼此的模板和引物进行PCR，具体步骤如下：提前开起PCR仪预热，将2×TaqMasterMix25μL、P10.5μL、P20.5μL、RNase-Freewater24μL加入到PCR反应管中，混合均匀，瞬时离心后，置于PCR仪中，反应条件为：94℃预变性2min；30个循环；72℃终延伸5min，得抗菌肽基因；