[发明专利]组织工程皮肤种子表皮角质形成细胞高拟体内细胞外基质附着体外筛选培养方法

权利要求书

1.一种用于筛选和培养组织工程皮肤种子表皮角质形成细胞的培养基组合，其特征在于，其包括：

培养液A：灭活胎牛血清40～60ml、转铁蛋白5～15μg/ml、维生素B40.5～1×10^-4/L、维生素C1～3μg/ml、胰岛素2～4μg/ml、CaCl₂0.2～0.3mmol/l、霍乱霉素2.5～4.5u/L、EGF5～25ng/ml、氢化可的松0.4μg/ml、商用培养基DMEM/F12(3:1)或K-SFM，定容到500ml；其中，采用K-SFM时，所述EGF为5～8ng/ml；

培养液B：灭活胎牛血清80ml、转铁蛋白6～17μg/ml、腺苷10～25mg/ml、维生素B40.5～1×10^-4/L、胰岛素2～3μg/ml、EGF5～25ng/ml、牛脑垂体提取物(BPE)1～3mg/L、CaCl₂0.1～0.3mmol/l、氢化可的松0.3μg/ml、霍乱霉素2.5～4.5u/L、维生素C1～3μg/ml、商用培养基DMEM与商用培养基F12(1：1)或K-SFM，定容到500ml，PH控制在7.2～7.4；其中，采用K-SFM时，所述EGF为5～6ng/ml；

培养液C:灭活胎牛血清30ml、转铁蛋白6～17μg/ml、腺苷10～25mg/ml、维生素B40.5～1×10^-4/L、维生素C1～3μg/ml、胰岛素4～6μg/ml、EGF5～25ng/ml、bFGF10～18ng/ml、牛脑垂体提取物BPE1.5～3mg/L、CaCl₂0.2～0.4mmol/l、干细胞生长因子SCF5～15ng/ml、氢化可的松0.3μg/ml、商用培养基DMEM与商用培养基F12(1：1)或K-SFM，定容到500ml，PH7.2～7.4，其中，采用K-SFM时，所述EGF为5ng/ml。

2.一种制备高拟体内细胞外基质的方法，其特征在于，其包括步骤：

a)取离体材料及皮肤消毒处理；b)脱细胞处理；将消毒或经脱细胞处理的皮肤进一步进行低温、脱水、辐照灭菌处理；

所述步骤b)中的脱细胞方法选自冷酶交联剂法、酶－非离子表面活性剂－络合剂联合法、络合剂加盐-阴离子表面活性剂法或胰酶联合EDTA交联液法。

3.按权利要求2所述的方法，其特征在于，其中冷酶交联剂法中包括：加入0.1～0.25％蛋白酶冰浴冷消12～48h，用含0.25％戊二醛磷酸缓冲溶液，PH在7.20～7.40之间，交联4～6h，超纯水或注射用水冲洗8～10次。

4.按权利要求2所述的方法，其特征在于，其中酶－非离子表面活性剂－络合剂联合法中包括：0.1～0.25％中性蛋白酶与0.01～0.02％EDTA，0.3～0.6％的TritonX－100溶液，室温下作用24～48h。

5.按权利要求2所述的方法，其特征在于，其中络合剂加盐-阴离子表面活性剂法中包括：0.01～0.02％EDTA含0.6～0.8mol/L氯化钠溶液，37℃下作用12～24h，后用0.2～0.5％SDS溶液，室温下作用30～60min。

6.按权利要求2所述的方法，其特征在于，其中胰酶联合EDTA交联液中包括：1：2的0.25～0.40％胰蛋白酶和0.02～0.04％EDTA，37℃快速消化10～60min，交联液中交联4～6h，交联后用超纯水或注射用水冲洗8～10次。

7.由权利要求2-6所述任一方法制备的高拟体内细胞外基质。

8.权利要求2-6所述任一方法制备的高拟体内细胞外基质或者权利要求7所述的高拟体内细胞外基质在用于筛选表皮干细胞中的用途。