[发明专利]组织工程皮肤种子表皮角质形成细胞高拟体内细胞外基质附着体外筛选培养方法

说明书

一、技术领域：

本发明属于生物组织工程皮肤种子角质形成细胞(KC)技术，组织工程领域。涉及一种体外构建高模拟体内贴附环境分离筛选，皮肤角质形成(KC)细胞的培养、扩增技术。本发明获得的KC细胞应用于组织工程皮肤构建技术中的活性种子细胞。

二、背景技术：

皮肤是人体最大的器官，参与抵御生物入侵、紫外线辐射以及防止水分丢失、调节体温维持个体外貌等方面起着十分重要的生理作用，其是人体免疫系统组成的重要的一部分，而皮肤细胞是构成这器官的基本单元，皮肤细胞基础研究领域是揭示皮肤健康、发育、预防、治疗的重要科研途径。

细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)广泛存在于细胞间隙的基本填充成分，是细胞新陈代谢、生长、繁殖、分化、表达、传递、互惠所依赖的及其重要场所。早期研究学者认为.外基质只是一种组织内、细胞外的单纯的支持结构。Hauschka和Konigsberg在1966年研究发现填充组织间隙的胶原与促进成肌细胞转化肌管的现象。并在两年之后，得以证明学者们才对这种稳定外物质微环境有了新的认识和思考。

Hay在11年后报道了ECM对胚胎发育过程具有重要的诱导作用。ECM影响细胞行为的现象得以关注并进行广泛的研究但是并没有成型的理论基础佐证ECM与细胞的密切关系。直到1982年有学者提出证明并建立ECM与细胞骨架和核基质之间“动态互惠”的模型。在这个模中，ECM分子与细胞表面受体互相作用，然后把信号通过细胞膜传导进入细胞浆中，引起从细胞骨架到细胞核的一系列变化，引起某些特定基因的表达。

并证明这些基因的表达产物又可以反过来对ECM发生作用，今天的许多研究证实了这个模型的合理性，并且证明细胞和ECM相互作用直接参与了细胞的黏附、生长、游走、分化和程序性死(凋亡)的过程；外基质参与调节细胞因子、生长因子的活性；还能够直接激活、启动细胞内信号传导机制。由于这种对细胞的调节和对信号的传导作用。因此，我们必须充分了解细胞外基质的化学的、物理的、生物学性质和功能及其在组织的形成和修复中的作用，才能更好地应用这些生物材料构建成为组织接受，乃至模拟组织完善再生的“生物构架”。我们建立的高拟细胞外基质材料利用的恰是反向理论，指导我们深入开展对ECM的认识，同时也反作用得到我们可利用的干细胞，这种研究模式促进学科前行及发展。

角质形成细胞在正常皮肤组织表皮层，体外培养可形成皮肤层组织，体外培养具有长期生长潜能并可形成克隆。是愈合修复创面，皮肤更新代谢再生的重要参与者。但由于目前缺乏理想筛选方法，对KC细胞进行安全筛选报道较少。

本发明涉及的角质形成细胞(KC)是表皮细胞主要组成部分，根据其不同的分化过程及细胞形态通常分为：基底细胞层、棘细胞层、颗粒细胞层和角质层。KC的培养技术已广泛应用于皮肤病理学、皮肤美容整复、生理学、药理学、药物毒理学、学组织工程学和基因治疗等方面。然而在临床治疗级KC的培养中人们还未取得理想的结果。

角质形成细胞(KC)来源于外胚叶，属于常变细胞，不断自我更新，在机体发育历程中，逐渐分化形成表皮、毛囊上皮主要构成细胞，表皮中90％以上属于该细胞，余下由黑素细胞、郎格汉斯、梅克尔细胞构成。

最常用于皮肤损伤的修复，如大面积烧伤、植皮手术等，可以应用该细胞与生物支架材料结合，作为皮肤覆盖物或替代物的组织工程皮肤。作为组织模块基本构建常见主要种子元件。

表皮角质形成细胞存在于表皮层，周围血供良好，营养丰富、所处微环境具有优异性；在损伤或生长刺激等因素下可自我更新增殖能力强；体外克隆能力突出等优势细胞特征。创伤修复的再生重建重要愈合细胞。

现有技术传统筛分方法中，因为皮肤细胞对基底膜有较强的粘附性贴附生长习性，所以利用细胞外基质该种特性进行培养筛选。目前传统的皮肤细胞筛选如下阐述：