[发明专利]一种新生仔猪肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法

权利要求书

1.一种新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），取日龄为1日龄内的新生健康仔猪的小肠，并将小肠剪成长5-10cm的小肠段，然后将小肠段沿着轴向剪开，露出粘膜面，备用；

步骤（2），将经步骤（1）处理的小肠段粘膜面采用冲洗液冲洗，至冲洗液清澈透亮为止，然后剪下小肠绒毛，将小肠绒毛加入到新的冲洗液中，每克小肠绒毛需要15-20mL冲洗液，再离心，弃上清液，得到小肠绒毛组织团块；

步骤（3），将步骤（2）得到的小肠绒毛组织团块加入到温育至37℃的胰酶消化液中，每毫升胰酶消化液中小肠绒毛组织团块的加入量为0.075-0.1g；然后将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后，补加胰酶消化液，混匀，置于37℃水浴锅内温育消化并持续震荡，10-15min后，取出，再向其中加入第一培养液，混匀后，将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后采用100目无菌铜网过滤，取滤液，离心，弃上清液，得到第一细胞团块；

其中，补加的胰酶消化液的体积是原胰酶消化液体积的4倍；第一培养液的加入体积是补加的胰酶消化液体积的1.25倍；

步骤（4），向步骤（3）得到的第一细胞团块中加入第二培养液后，将细胞团块吹散并使其悬浮，第二培养液的加入体积是步骤（3）补加的胰酶消化液体积的0.5倍；接着补加第二培养液，混匀，得到混合液，补加的体积是第一次使用的第二培养液体积的一半；然后将混合液转移到带透气膜的细胞培养瓶中，于37℃二氧化碳恒温培养箱内培养过夜；

步骤（5），摇晃经步骤（4）过夜培养的细胞培养瓶至死细胞、粘液和组织块悬浮起来后，倾去培养液，重新加入第二培养液，于37℃二氧化碳恒温培养箱内继续培养，重新加入第二培养液的体积是步骤（4）第一次使用的第二培养液体积的0.75倍；

培养3-5天更换培养液，更换时，若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积不足20%时，换液时倾去1/2培养瓶中的培养液，再补加新鲜的第二培养液至与更换前培养液体积相同；若细胞贴壁面积占培养瓶培养面积超过20%时，则倾去所有培养瓶中的培养液，加入新鲜的第二培养液至与更换前培养液体积相同；

更换培养液后，继续培养，直至培养瓶中细胞生长成为单层细胞，该单层细胞即猪小肠绒毛上皮原代细胞株F1代；

步骤（6），将步骤（5）得到的生长有单层细胞的培养瓶倾去培养液后，加入胰酶消化液涮洗单层细胞，加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.5倍；

涮洗后倾去胰酶消化液，再重新加入胰酶消化液，重新加入的胰酶消化液的体积是步骤（3）第一次使用的胰酶消化液体积的0.25倍，于37℃二氧化碳恒温培养箱内晃动消化至细胞单层开始出现片状脱落时，加入第二培养液，第二培养液的加入体积与涮洗单层细胞的胰酶消化液体积相同，并将单层细胞吹至悬浮后，补加第二培养液，补加第二培养液的体积是涮洗单层细胞的胰酶消化液体积的5倍；然后平均分装至两个与原培养瓶相同的培养瓶，再将分装后的培养瓶置于37℃二氧化碳恒温培养箱培养2-3天，待细胞生长成为单层时，该单层细胞即为猪小肠绒毛上皮原代细胞株F2代；重复本步骤中倾去培养液到待细胞生长成为单层时中的所有步骤，继续传代培养；

其中，步骤（4）和步骤（6）中所述的二氧化碳恒温培养箱内CO₂的体积浓度为5%；

所述的冲洗液的制备方法如下：

首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1-3ml溶解于97-99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；

接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000 IU/mL青霉素溶液1mL和40000µg/mL链霉素溶液1mL一起加入到97 mL的MEM培养基内，即得到冲洗液；

所述的第一培养液的制备方法如下：

首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1-3ml溶解于97-99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；

接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000 IU/mL青霉素溶液1mL和40000µg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87 mL的MEM培养基内，再加入10mL新生犊牛血清后混匀，即得到第一培养液；

所述的第二培养液的制备方法如下：

首先取质量浓度为10%的乙基环丙沙星溶液1-3ml溶解于97-99ml纯净水内，混匀，经0.1微米滤膜过滤除菌后，即得到100×乙基环丙沙星溶液；

接着分别取100×乙基环丙沙星溶液1mL、40000 IU/mL青霉素溶液1mL和40000µg/mL链霉素溶液1mL一起加入到87 mL的DMEM培养基内，再加入10mL胎牛血清后混匀，即得到第二培养液；

所述的胰酶消化液的制备方法如下：称取胰酶活力为1:250的Gibic胰酶干粉0.6克、碳酸氢钠0.64克、ETDA二钠0.224克、氯化钠8.9克、氯化钾0.44克和葡萄糖1.1克，然后将它们一起加入到1000ml纯净水内，溶解后经0.1微米滤膜过滤后，取滤液，即为胰酶消化液。