[发明专利]一种新生仔猪肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法

说明书

本发明涉及一种新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，属于生物技术领域。本发明的制备方法采用新生仔猪的小肠段作为材料，提供了一种快速、便捷、高效率的新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，制备的猪小肠绒毛上皮原代细胞株可传代至20‑30代次以上。本发明制备方法可在短时间内制备出大量健康、单一、纯化的猪小肠绒毛上皮原代细胞，供细胞生物学、预防兽医学、病毒学、免疫学、动物营养学等实验研究或猪腹泻病毒类疫苗生产及抗原制备。同时，本发明首次制备出健康、单一、纯化的猪小肠绒毛上皮原代细胞株，填补了生命学科研究领域缺乏单一、纯化的猪小肠绒毛上皮原代细胞株的空白，具有积极的效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新生仔猪肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法。

背景技术

现有细胞培养技术虽然历经几十年的发展，并且取得了长足发展，但对于一些特殊组织器官的细胞体外培养技术进展却停滞不前，截至今日仍然没有成功制备出单一、纯化的猪小肠绒毛上皮原代细胞株，更不用提培育出猪小肠绒毛上皮传代细胞系了。现有的猪小肠绒毛上皮细胞制备方法通常是无菌取出胎猪小肠段后，连同小肠绒毛上皮及基底层组织一起（包含小肠平滑肌及结缔组织）用剪刀剪碎，然后通过0.025%浓度的胰酶消化、分散后进行培养，因此所获得的培养物仅含有极少量的猪小肠绒毛上皮细胞，更多的则是小肠组织细胞。这是因胎猪在出生前未吮乳，其消化道粘膜未受到食物刺激，致使小肠绒毛未完全生长和舒展所致。因此当需要对单一、纯化的小肠绒毛上皮细胞开展实验研究时，会因小肠绒毛上皮细胞量极少、且混合有小肠组织细胞，而造成实验结果的较大偏差、误差甚至错误。另外，用现有的污染控制技术，即添加双抗，几乎无法控制该培养物的污染。

在病毒学或预防兽医学等研究领域，很多腹泻病毒诸如：猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、轮转病毒、冠状病毒、博卡病毒（BOV）、库布病毒（KOV）、肠道病毒、诺如病毒、札幌病毒等的细胞受体，均位于小肠绒毛上皮细胞上。因此为了提高以上腹泻病毒的分离成功率，以及开展后续的病原学、免疫学、病理学、疫苗研发等重要研究，完全有必要研究出一种能高效、便捷地获得单一猪小肠绒毛上皮传细胞的方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种新生仔猪肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，该方法能够简易、方便、高效地制备出单一、纯化的猪小肠上皮绒毛原代细胞株，可应用于猪腹泻病毒分离、动物营养调控及机制研究或细胞生物学等领域。

本发明采用的技术方案如下：

一种新生仔猪小肠绒毛上皮原代细胞株的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1），取日龄为1日龄内的新生健康仔猪的小肠，并将小肠剪成长5-10cm的小肠段，然后将小肠段沿着轴向剪开，露出粘膜面，备用；

步骤（2），将经步骤（1）处理的小肠段粘膜面采用冲洗液冲洗，至冲洗液清澈透亮为止，然后剪下小肠绒毛，将小肠绒毛加入到新的冲洗液中，每克小肠绒毛需要15-20mL冲洗液，再离心，弃上清液，得到小肠绒毛组织团块；

步骤（3），将步骤（2）得到的小肠绒毛组织团块加入到温育至37℃的胰酶消化液中，每毫升胰酶消化液中小肠绒毛组织团块的加入量为0.075-0.1g；然后将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后，补加胰酶消化液，混匀，置于37℃水浴锅内温育消化并持续震荡，10-15min后，取出，再向其中加入第一培养液，混匀后，将小肠绒毛组织团块吹散并使其悬浮后采用100目无菌铜网过滤，取滤液，离心，弃上清液，得到第一细胞团块；

其中，补加的胰酶消化液的体积是原胰酶消化液体积的4倍；第一培养液的加入体积是补加的胰酶消化液体积的1.25倍；