[发明专利]一种微生物核糖体的制备方法及其在制备重组蛋白中的应用

权利要求书

1.一种制备核糖体的方法，包括步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)；

所述步骤(a)为制备核糖体粗提液；所述制备核糖体粗提液依次包括如下步骤：

(a1)取微生物，进行高压细胞破碎，然后离心收集上清液；所述高压为500bar以上的压力；所述步骤(a1)中，将所述微生物悬浮于菌体悬浮液并加入DNaseI，然后进行所述高压细胞破碎；所述菌体悬浮液如下：溶剂为pH7.6、25mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度为：15mM MgCl₂、150mM KCl和7mM β-mercaptoethanol；

(a2)取步骤(a1)得到的上清液，通过硫酸铵沉淀的方式去除杂蛋白，然后离心收集上清液；所述“通过硫酸铵沉淀的方式去除杂蛋白”中的硫酸铵浓度为1.5M；

所述步骤(b)为：取步骤(a2)得到的上清液，通过HiTrap Butyl FF疏水层析柱纯化核糖体；所述步骤(b)中，纯化核糖体的方法如下：取步骤(a2)得到的上清液，过滤除菌后上样于HiTrap Butyl FF疏水层析柱，用溶液Ⅱ进行洗脱并收集洗脱峰；所述溶液Ⅱ由1体积份缓冲液A和1体积份缓冲液B组成；所述缓冲液A如下：溶剂为pH7.6、25mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度为：15mM MgCl₂、150mM KCl、1.5M(NH₄)₂SO₄和7mM β-mercaptoethanol；所述缓冲液B如下：溶剂为pH7.6、25mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度为：15mM MgCl₂、150mMKCl和7mM β-mercaptoethanol；

所述步骤(c)为：取步骤(b)收集的溶液，通过蔗糖梯度离心纯化核糖体；所述步骤(c)中，纯化核糖体的方法如下：取离心管，先加入1体积份蔗糖缓冲液，然后加入1体积份步骤(b)收集的溶液，使两者之间形成分界面；然后取所述离心管，放入超离心转子中，离心取沉淀；所述蔗糖缓冲液如下：溶剂为pH7.6、25mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度为：15mMMgCl₂、150mM KCl、7mM β-mercaptoethanol和质量百分含量为30％的蔗糖；

所述微生物为嗜热栖热菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微生物为嗜热栖热菌HB8。

3.一种制备核糖体的方法，依次包括如下步骤：

(1)取30g嗜热栖热菌HB8的菌体，加入30ml菌体悬浮液和2微升DNaseI以悬浮菌体，然后采用高压细胞破碎仪在600bar压力下进行细胞破碎，然后4℃、15000rpm离心30分钟，收集上清液；

所述菌体悬浮液如下：溶剂为pH7.6、25mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度为：15mMMgCl₂、150mM KCl和7mM β-mercaptoethanol；

(2)取步骤(1)得到的上清液，加入硫酸铵至浓度为1.5M，4℃搅拌30分钟，然后4℃、15000rpm离心30分钟，收集上清液；

(3)取步骤(2)得到的上清液，用0.45微米滤膜过滤除菌，得到滤液；

(4)将步骤(3)得到的滤液上样于HiTrap Butyl FF疏水层析柱，用溶液Ⅱ进行洗脱并收集洗脱峰；

所述溶液Ⅱ由1体积份缓冲液A和1体积份缓冲液B组成；

所述缓冲液A如下：溶剂为pH7.6、25mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度为：15mMMgCl₂、150mM KCl、1.5M(NH₄)₂SO₄和7mM β-mercaptoethanol；

所述缓冲液B如下：溶剂为pH7.6、25mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度为：15mMMgCl₂、150mM KCl和7mM β-mercaptoethanol；

(5)取离心管，先加入1体积份蔗糖缓冲液，然后加入1体积份步骤(4)收集的溶液，使两者之间形成分界面；

所述蔗糖缓冲液如下：溶剂为pH7.6、25mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度为：15mMMgCl₂、150mM KCl、7mM β-mercaptoethanol和质量百分含量为30％的蔗糖；

(6)完成步骤(5)后，取所述离心管，放入45Ti超离心转子中，4℃、36000rpm、离心10小时，取沉淀；

(7)将步骤(6)得到的沉淀溶于核糖体保存缓冲液，得到核糖体溶液；

所述核糖体保存缓冲液的溶剂为pH7.6、20mM的Hepes-KOH缓冲液；溶质及其浓度为：15mM MgCl₂、150mM KCl和7mM β-mercaptoethanol。