[发明专利]一种微生物核糖体的制备方法及其在制备重组蛋白中的应用

说明书

本发明公开了一种微生物核糖体的制备方法及其在制备重组蛋白中的应用。本发明提供了一种制备核糖体的方法，包括步骤(a)；所述步骤(a)为制备核糖体粗提液；所述制备核糖体粗提液依次包括如下步骤：(a1)取微生物，进行高压细胞破碎，然后离心收集上清液；所述高压为500bar以上的压力；(a2)取步骤(a1)得到的上清液，通过硫酸铵沉淀的方式去除杂蛋白，然后离心收集上清液；所述“通过硫酸铵沉淀的方式去除杂蛋白”中的硫酸铵浓度为1.5M。本发明制备的嗜热栖热菌来源的核糖体纯度高并且结构完整，可用于嗜热菌体外无细胞翻译体系，用于各类嗜热蛋白的体外表达以及中温蛋白质的热稳定性进化方面的研究。

技术领域

本发明涉及一种微生物核糖体的制备方法及其在制备重组蛋白中的应用。

背景技术

蛋白质是构成生命体的基本功能单元，其作用机制的解析是理解生物体系功能和作用机理的关键。X射线晶体学、冷冻电镜和核磁共振(NMR)揭示的蛋白质结构为解析蛋白质的作用机制提供了直观的证据，而这个过程中的关键步骤是重组蛋白的制备，而无细胞蛋白翻译系统则为蛋白制备提供了有效的保障。

与胞内表达体系相比，无细胞蛋白翻译体系可以表达对细胞有毒害的蛋白质，可以对蛋白质产物进行同位素标记或者在产物中添加非天然氨基酸，以便于产物的检测和后续修饰，简化了蛋白产物的后续纯化过程，并缩短了反应时间。

无细胞翻译体系由于其具有下述重要优点，最近十年来被广泛的应用于基础研究和应用研究中：1)无细胞翻译体系操作简单，可以有目的在蛋白质中加入特定标记的氨基酸，如带有放射性元素等，方便对目标蛋白进行NMR结构或X射线晶体结构的测定；2)在后基因组时代，蛋白质的高通量表达合成纯化平台具有很重要的意义，无细胞体外表达体系可以进行大规模的蛋白质合成，为蛋白质组学的研究提供了强有力的工具；3)现有的从组织中提取医药蛋白的费用昂贵，大大阻碍了医药蛋白质的广泛研究与应用，而无细胞翻译体系可以大大降低医药蛋白质的制备成本，从而可以普及医药蛋白的广泛应用；4)无细胞翻译体系还可以用于蛋白质工程或酶工程的研究中，特别是，定向进化是改善蛋白质功能特性的重要手段之一，建立在无细胞翻译体系基础上的mRNA展示以及核糖体展示等方法进一步拓宽了蛋白质进化的研究途径；5)无细胞翻译体系有助于膜蛋白的合成表达，膜蛋白是很多医药分子的靶蛋白，但由于膜蛋白具有特殊结构，难以在细胞内过量表达，其高表达常常是制约膜蛋白结构和功能研究的重要限制性因素；6)此外，无细胞翻译体系也有助于类病毒颗粒研究，类病毒颗粒是由一种或多种蛋白质自发组装的复合体，在结构上与病毒非常类似，可以代替病毒激活免疫系统，由于其不含有遗传物质，因此可以作为安全疫苗用于临床，体内制备类病毒颗粒由于受制于细胞环境影响，首先制备量有限，其次体内表达容易被其他体内因子污染，临床应用具有很大的风险，而无细胞翻译体系可以大量制备具有临床安全性的类病毒颗粒。

无细胞翻译体系自身类似于一个蛋白质合成工厂，含有蛋白质合成过程所需要的各种因子，如转录、翻译、蛋白质折叠和能量代谢等，在此基础上，只要添加合适的翻译模板，就能合成出相应的蛋白质。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物核糖体的制备方法及其在制备重组蛋白中的应用。

本发明提供了一种制备核糖体的方法(方法甲)，包括步骤(a)；所述步骤(a)为制备核糖体粗提液；所述制备核糖体粗提液依次包括如下步骤：

(a1)取微生物，进行高压细胞破碎，然后离心收集上清液；所述高压为500bar以上的压力(具体可为600bar压力)；

(a2)取步骤(a1)得到的上清液，通过硫酸铵沉淀的方式去除杂蛋白，然后离心收集上清液(核糖体粗提液)；所述“通过硫酸铵沉淀的方式去除杂蛋白”中的硫酸铵浓度为1.5M。