[发明专利]一种检测小分子G蛋白Rap1活性的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种检测小分子G蛋白Rap1活性的方法，其具体步骤如下：

步骤1构建GST-RalGDS-RBD原核表达质粒

查询NCBI数据库中人RalGDS基因对应798-885位氨基酸残基的编码序列,对照原核表达载体pGEX-6P-1的多克隆位点(图1所示),选择其中的BamHI和EcoRI位点作为酶切位点设计上游引物(5′-CGCGGATCCGCGctgccgctctacaacc-3′)和下游引物(5′-CCGGAATTCCGGtcagaagatgcccttggcaa-3′)，以人肝文库为模版，PCR扩增得到目的片段；经过琼脂糖凝胶电泳分离后用凝胶回收试剂盒回收，回收的目的片段和pGEX-6P-1空载体分别经BamHI和EcoRI双酶切后，再次经过琼脂糖凝胶电泳分离回收，回收的目的片段和载体以5:1的比例混合；然后用T₄DNA连接酶于16℃连接过夜，随后用该体系转化DH5α大肠杆菌，涂平板并挑选其中的阳性克隆，所选的阳性克隆经过限制性内切酶切后得到大约418bp的目的片段；GST-RalGDS-RBD原核表达质粒测序得到的目的片段和NCBI数据库上的编码序列完全一致；

步骤2GST-RalGDS-RBD融合蛋白的原核表达和纯化

用上述构建的GST-RalGDS-RBD质粒转化BL21大肠杆菌，按1%转接于100mLLB培养基中，37℃180r/min振荡培养至对数生长期(D_600nm=0.6);随后按100μM/L终浓度加入IPTG，20℃180r/min振荡诱导过夜；次日4℃4000rpm10min离心收集菌液，将得到的大肠杆菌用30mL缓冲液PB[30mLPBS中含0.5mM/LDTT、2μg/mLAprotimin、2μg/mLLeupeptin、1mM/LPMSF、1mM/LNa3VO4、10mM/LNaF]重悬，然后高压破碎，随后超声波进一步破碎；4℃13000rpm10min离心裂解产物，取上清，将预先经过平衡的300μL谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠与离心后得到的上清混合，4℃混旋转2h，然后预冷的PB缓冲液洗涤谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠，利用洗脱缓冲液[5ml配方：250μL1M/LTris-Cl,ph7.6、4.75mL超纯水、0.0154g还原型谷胱甘肽]把GST-RalGDS-RBD从凝胶珠上洗涤下来；最后利用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色方法检测纯化的GST-RalGDS-RBD融合蛋白；

步骤3使用GSTpull-down和Western-Blot方法检测Rap1的活性水平

将HEK293细胞接种于100cm²培养皿，待细胞长到80%密度时，利用脂质体转染质粒Rap1V12(rap1基因组成型活性形式，表达产物相当于Rap1-GTP)；24h后收集细胞，先用PBS洗一次，然后用IPbuffer裂解液冰上裂解细胞，12000rpm离心10min,取上清，留取其中20%作为对照；转染Rap1V12的细胞上清均分为两份，分别与偶联了GST空载体和GST-RalGDS-RBD的谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠混合，置摇床上4℃混旋转1h，4℃6000rpm离心，用IP裂解液洗涤三次，最后用微量进样器吸干Ep管内所有剩余液体，加入30μlSDS-PAGEloadingbuffer，煮沸10min，最后通过western-blot检测目标Rap1蛋白；结果如图5所示，其中以GST空载体作为阴性对照，GST-RalGDS-RBD能够与HEK293细胞中表达的Rap1-GTP发生相互作用，并且这种相互作用具有很强的特异性。