[发明专利]一种检测小分子G蛋白Rap1活性的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物领域，一种检测小分子G蛋白Rap1活性的方法及试剂盒。

背景技术

小分子G蛋白Rap1属于Ras家族，其结构类似于Ras，当结合GTP后处于活性状态(Rap1-GTP)，结合GDP后则处于非活性状态(Rap1-GDP)。在细胞内，Rap1通过Rap1-GTP与Rap1-GDP之间的动态转换起分子开关的作用，胞外信号通过特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子调控Rap1与GTP结合，从而激活Rap1；胞内特异性GTP酶激活蛋白促进GTP水解，从而使Rap1失活。活化的Rap1信号通过其下游不同的信号分子调控不同的生物学功能。胞外刺激因子例如生长因子、细胞因子、趋化因子以及第二信使Ca²⁺、DAG、cAMP等，可通过鸟嘌呤核苷酸交换因子激活Rap1从而调控不同的信号通路；而活化的大麻素受体可以通过下调GTP酶激活蛋白使已被激活的Rap1信号始终处于激活状态。因此，Rap1信号介导的生理功能呈现出多样性，对细胞增殖、分化、粘附、迁移等起不同的调控作用。Rap1通过Raf/ERK_1/2、p38/MAPK/CREB或PI3K调控肿瘤细胞的增殖，还能通过调节钙粘着蛋白介导的细胞粘附作用而影响肿瘤细胞的浸润和迁移;在淋巴系统中，Rap1的病理性持续激活导致骨髓白血病；在神经系统中Rap1信号能促进神经元极性建立和轴突生长，还能调节神经突生长。Rap1信号能够调控神经突触结构和功能的可塑性变化,与神经元的迁移也具有相关性。因此，检测Rap1蛋白的活性对于了解肿瘤的增殖和迁移，以及研究其在神经系统中的功能具有重要意义。

发明内容

本发明的发明目的之一在于是提供一种检测小分子G蛋白Rap1活性的方法，利用该方法可检测组织或体外培养的细胞系中Rap1的活性水平。

本发明的目的之二在于利用上述方法检测小分子G蛋白Rap1活性的的试剂盒。

为解决上述问题，本发明提供包含谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠、IPbuffer、SDS-PAGEloadingbuffer、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂及可特异性结合Rap1-GTP的GST-RalGDS-RBD融合蛋白与可特异性识别Rap1抗体的试剂盒及检测方法。

其技术解决方案如下：一种检测小分子G蛋白Rap1活性的方法，根据人RalGDS基因的Rap1结合结构域（RBD）能够特异结合Rap1-GTP的特性，构建GST-RalGDS-RBD原核表达质粒，经诱导纯化得到GST-RalGDS-RBD蛋白，并利用GSTpull-down和Western-Blot方法检测小分子G蛋白Rap1活性的方法；

其具体步骤如下：

步骤1构建GST-RalGDS-RBD原核表达质粒

RalGDS是Rap1下游的效应因子，含有Rap1结合结构域(位于其798-885位氨基酸残基)，可以直接结合Rap1-GTP。查询NCBI数据库中人RalGDS基因对应798-885位氨基酸残基的编码序列,对照原核表达载体pGEX-6P-1的多克隆位点(图1所示),选择其中的BamHI和EcoRI位点作为酶切位点设计上游引物(5′-CGCGGATCCGCGctgccgctctacaacc-3′)和下游引物(5′-CCGGAATTCCGGtcagaagatgcccttggcaa-3′)，以人肝文库为模版，PCR扩增得到目的片段。经过琼脂糖凝胶电泳分离后用凝胶回收试剂盒回收，回收的目的片段和pGEX-6P-1空载体分别经BamHI和EcoRI双酶切后，再次经过琼脂糖凝胶电泳分离回收，回收的目的片段和载体以5:1的比例混合。然后用T₄DNA连接酶于16℃连接过夜，随后用该体系转化DH5α大肠杆菌，涂平板并挑选其中的阳性克隆，所选的阳性克隆经过限制性内切酶切后得到大约418bp的目的片段(图2所示)。GST-RalGDS-RBD原核表达质粒测序得到的目的片段和NCBI数据库上的编码序列完全一致(图3所示)。这表明GST-RalGDS-RBD原核表达质粒构建成功。

步骤2GST-RalGDS-RBD融合蛋白的原核表达和纯化