[发明专利]一种用青蒿生产菌丝霉素的方法有效
| 申请号： | 201510777822.5 | 申请日： | 2015-11-13 |
| 公开（公告）号： | CN105255939B | 公开（公告）日： | 2018-12-25 |
| 发明（设计）人： | 夏新界;崔延春;余艳;尹晟 | 申请（专利权）人： | 长沙中科晶博生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;A01H5/00;A01H6/14 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 410125 湖南省长沙市芙蓉*** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 青蒿 菌丝 菌丝霉素基因 重组质粒 密码子偏好性 实时定量PCR 核苷酸序列 外源蛋白质 细胞 表达系统 蛋白产品 酶切鉴定 阳性菌株 植物表达 转化植株 表达量 抗菌肽 农杆菌 构建 扩增 转化 优化 筛选 翻译 生产 积累 改造 安全 保证 | ||
1.一种用青蒿生产菌丝霉素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)改造载体T202；改造后的载体T202序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)构建青蒿中表达改造后的菌丝霉素基因的重组质粒T202-Plec，重组质粒T202-Plec的序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)用重组质粒T202-Plec转化青蒿；
(4)筛选阳性转基因青蒿植株，获得生产菌丝霉素的青蒿植株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述改造载体T202的过程如下：
(a)以pCambia1300为模板，用如下引物对TDNA的pRB序列进行PCR扩增：
引物pRB-F1:5’-
引物pRB-R1:5’-
(b)将PCR扩增得到的pRB序列测序鉴定；将正确的pRB序列连接到pCambia1301上，得到载体pC13001T，载体pC13001T序列如SEQ ID NO.3所示；
(c)用KpnI和SmaI酶切Actin启动子，同时用KpnI和PmacI酶切载体pC13001T，将酶切的载体pC13001T与酶切的Actin启动子进行连接，构建成改造后的载体T202。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述构建青蒿中表达改造后的菌丝霉素基因的重组质粒T202-Plec的过程如下：
(a)合成改造后的菌丝霉素基因序列，并将其保存于PMD19Simple质粒中，改造后的菌丝霉素基因序列如SEQ ID NO.4所示；
(b)用如下引物对保存于PMD19Simple质粒中的改造后的菌丝霉素基因进行扩增：
引物Plec F1：5’
引物Plec R1：5’
(c)将PCR扩增得到的改造后的菌丝霉素基因测序鉴定；将正确的改造后的菌丝霉素基因与T-载体连接，得到载体Plec-T，载体Plec-T序列如SEQ ID NO.5所示；
(d)用Pst I、Xba I分别酶切改造后的载体T202和载体Plec-T，将酶切的改造后的载体T202和酶切的载体Plec-T连接，构建成重组质粒T202-Plec。
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