[发明专利]一种用青蒿生产菌丝霉素的方法

说明书

本发明公开了一种用青蒿生产菌丝霉素的方法，包括以下步骤：a、改造并获得载体T202 b、优化并扩增菌丝霉素基因；c、构建青蒿细胞中表达菌丝霉素基因的重组质粒T202‑Plec；d、用重组质粒T202‑Plec转化农杆菌EHA105细胞；e、筛选阳性菌株，并进行酶切鉴定；f、转化青蒿，获得阳性含抗菌肽菌丝霉素的青蒿转化植株；g、实时定量PCR(qRT‑PCR)鉴定菌丝霉素的表达量。本发明采用的青蒿表达系统具有以下优点：根据青蒿的密码子偏好性，对菌丝霉素基因的核苷酸序列进行了优化，保证了高效和稳定的mRNA转录、快速和准确的翻译以及较高的外源蛋白质积累；植物表达菌丝霉素成本低、安全、经济效益好；表达的蛋白产品可直接用于添加，无须纯化。

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种用青蒿生产菌丝霉素的方法。

背景技术

中国是畜牧养殖大国，每年生产的动物饲料在存放过程中因腐败变质引起的损失巨大。因此大量生产商在饲料中添加化学防腐剂，但残留在动物机体内的化学防腐剂不仅影响了畜禽产品的质量，还威胁到人们的身体健康，如引发肠胃炎等疾病，影响肝、肾功能等。另一方面，为了预防畜牧的疾病，动物饲料中长期大量地添加抗生素，由此引发的动物消化道紊乱、耐药性问题也日益严重。

抗菌肽(Antibacterial peptide，ABP)是动物先天性免疫的重要组成部分，抗菌谱广，对细菌、真菌、分枝杆菌、螺旋体、披膜病毒、支原体、衣原体、螺旋体以及一些恶性细胞(如肿瘤细胞)和艾滋病病毒都具有杀伤作用。由于抗菌肽主要是通过与细胞膜上的氨基酸相互作用，以此穿透细胞膜、扼杀细菌，所以细菌难以对其产生抗性。此外，抗菌肽是一种小分子多肽，是天然存在的一类物质，因而不存在残留的问题。因此发展具有自主知识产权的新型抗菌肽产品，替代化学防腐剂和抗生素，对于我国畜牧业的安全、健康、和谐发展具有重要意义。

防御素是动植物体内一类富含半胱氨酸的抗菌肽，对多种微生物均具有较强的防御能力，是目前颇具吸引力的一类新型候选抗菌药物。菌丝霉素是丹麦生物技术公司于2005年从腐生子囊菌的分泌蛋白中分离出的首例真菌防御素。菌丝霉素的成熟功能片段只有40个氨基酸，其分子量约为4.4KDa，对革兰氏阳性菌有较强的杀菌作用，例如肺炎链球菌、脓性链球菌、金黄色葡萄球菌等。此外，菌丝霉素无细胞毒性、无溶血性、脑脊液渗透性好，且能对抗肺炎球菌和肺炎链球菌，杀灭对传统抗生素有抵抗力的一些菌种，不产生耐药性，与传统使用的抗生素之间不存在交叉抗性，因此作为新一代抗生素替代品具有巨大的发展潜力。

由本公司之前发明的一种菌丝霉素在酿酒酵母中高效表达的方法，酵母生长速率快，菌丝霉素表达量高，易于高密度培养，适用于固体或液体发酵；发酵过程中，无需添加甲醇诱导，避免了因甲醇残留带来的危害；表达分泌的菌丝霉素易于分离纯化，产物纯度高。但是一旦由实验室扩展到工业化规模生产时，由于培养基中维持质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，因此外源菌丝霉素基因的表达量也随之下降。同时，相对于植物表达载体而言，酵母的生产成本、技术要求也更加严格。

而青蒿(Artemisia carvifolia)为一年生草本，具有清热、凉血、退蒸、解暑、祛风、止痒之效。花蕾期采收，割取地上部分，切碎，晒干后，可直接用作饲料添加。青蒿作为生产菌丝霉素的植物，还具有粗生易管，生长期短，投资少，收益快等优点。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种用青蒿生产菌丝霉素的方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述用青蒿生产菌丝霉素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)改造载体T202；改造后的载体T202序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)构建青蒿中表达改造后的菌丝霉素基因的重组质粒T202-Plec，重组质粒T202-Plec的序列如SEQ ID NO.2所示；